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低氮诱导表达基因、氮转运基因的功能研究以及水稻OsRHC基因家族分析

作　者: 马珂
导　师: 张启发；练兴明
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻氮代谢氮高效吸收和利用超量表达低氮诱导表达基因铵盐转运蛋白硝酸盐转运蛋白 OsRHC 逆境胁迫
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

水稻是世界重要的粮食作物。目前,随着全球耕地面积的不断减少,粮食危机逐渐显现,为了满足粮食需求,人们大量地向农田施入各种化学肥料以保证产量,特别是氮肥,因为氮肥是影响和制约粮食产量的最为重要的因素之一。然而,大量施入氮肥带来了许多负面影响,例如生产成本增加、经济浪费以及环境污染。传统的育种手段已经无法满足人们日益增长的粮食需求。因此,利用分子生物学技术快速高效地获得氮高效吸收和利用的转基因水稻新品种对我国水稻生产甚至是整个农业发展起着十分重要的意义。另外,各种非生物逆境(干旱、冷害和高盐等)对植物尤其是作物的生长和发育也有着非常重要的影响,因此研究和逆境相关的基因对提高作物对干旱、高盐和低温等逆境的耐受能力具有重要意义。本研究通过超量表达低氮诱导表达基因、铵盐转运蛋白基因(AMT)和硝酸盐转运蛋白基因(NR乃,对转基因植株进行表型分析和生理生化研究,以获得氮高效吸收和利用的转基因水稻新品种；通过对C3HC4类型的锌指蛋白家族成员进行生物信息学分析以及胁迫条件下的表达分析,找到一些和逆境相关的锌指蛋白成员。主要结果如下：1.使用生物信息学方法在NCBI数据库搜索获得水稻低氮诱导表达基因、铵盐转运蛋白基因(AMT)和硝酸盐转运蛋白基因(NRT)的序列信息；并通过cDNA文库和PCR扩增获得基因。以载体pCAMBIA1301S为基础,构建超量表达载体,以35S启动子启动基因在水稻中进行组成型大量表达。通过Southern和Northern杂交,对转基因植株进行转基因拷贝数和表达量的检测,来获得超量表达的单拷贝转基因植株。对转基因植株进行水培筛选和田间鉴定,找到和野生型植株表型有差异的转基因植株进行下一步研究。2.用Real-time PCR的方法检测水稻全生育期27个组织和器官中10个铵盐转运子基因(OsAMT1;1,OsAMT1;2, OsAMT1; 3,OsAMT2;1, OsAMT2;2, OsAMT2;3,OsAMT3;1, OsAMT3;2, OsAMT3;3,OsAMT4;1)的表达水平。结果表明：OsAMT1;1, OsAMT1;2, OsAMT2;1和OsAMT4;1在27个组织或器官中广泛表达,属于组成型表达的铵盐转运子,然而另外6个铵盐转运子基因特异地在某些组织或器官中表达如根,幼穗、胚乳等等。3.用Real-time PCR的方法检测氮饥饿以及不同氮源处理条件下铵盐转运子基因的表达变化。结果表明在缺氮条件下6个铵盐转运子(OsAMT1;3,OsAMT2;1, OsAMT2;3,OsAMT3;1,OsAMT3;2,OsAMT4;1)在地上部和地下部中的表达不发生改变,另外在不同的时间点5个基因在地上部或地下部的表达发生变化。另外,经过不同氮源处理后植株根中除了OsAMT1;1外,其他的铵盐转运子基因在转录水平发生改变。这些结果表明大多数的铵盐转运子基因在转录水平上至少能被一种氮源所影响,并且在氮饥饿条件下,一部分铵盐转运子基因的转录水平会快速发生改变使得植株能够适应外界改变的环境。4.利用农杆菌介导的遗传转化的方法将OsAMT2;1和OsAMT2;3这两个基因分别导入到水稻中花11中进行超量表达。经过水培筛选发现,和野生型对照中花11,超表达OsAMT2;1的转基因植株长势瘦弱,鲜重和分蘖数和对照相比分别减少30%,转基因植株根内游离铵含量和总氮含量大约上升了10%。超表达OsAMT2;3的转基因植株同样长势瘦弱,植株的鲜重和分蘖数与对照相比减少了大约30%,转基因植株根内的游离铵含量下降了10%。通过15N的吸收实验同样证明了超表达OsAMT2;3的转基因植株吸收铵的能力大约下降了10-15%。5.水稻中典型的C3HC4类型的锌指蛋白OsRHC一共有29个成员,对它们的基因结构、顺式作用因子、染色体定位、进化关系、以及表达作了系统的分析,并通过Real-time PCR对部分OsRHC基因在激素处理和逆境胁迫条件下的表达变化做出研究。分析结果表明29个OsRHC基因中有5个C3HC4型锌指蛋白成员特异地在生殖器官中表达,在非生物胁迫下12个基因在苗期受到激素或逆境的调节。这些结果对阐述C3HC4型锌指蛋白在植物生长发育和逆境响应中的作用非常有帮助。

全文目录

缩写名词表  7-8
摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章水稻低氮诱导表达基因、铵盐转运子基因和硝酸盐转运子基因的研究  13-57
  1 综述  13-29
    1.1 氮是重要的生命元素  13-15
      1.1.1 概述  13
      1.1.2 植物体内氮的含量和分布  13-14
      1.1.3 氮的营养功能  14-15
    1.2 硝态氮的吸收、同化与运输  15-22
      1.2.1 吸收  15
      1.2.2 同化  15-16
      1.2.3 植物中的硝酸盐转运子  16-18
      1.2.4 低亲和力N03转运蛋白基因(NRT1)  18-19
      1.2.5 高亲和力N03转运系统编码基因(NRT2和NAR2)  19-20
      1.2.6 转运蛋白基因的表达特性  20-22
    1.3 植物体对铵的吸收和氨的同化  22-26
      1.3.1 铵吸收  22
      1.3.2 铵的同化  22-23
      1.3.3 植物中的铵盐转运子  23-26
    1.4 研究植物中氮代谢相关基因功能的策略  26-28
      1.4.1 基因功能增加  26
      1.4.2 基因功能丧失或减弱  26-28
      1.4.3 微阵列  28
    1.5 本研究的目的和意义  28-29
  2 材料与方法  29-37
    2.1 水稻材料  29
    2.2 用于遗传转化的水稻基因片段  29
    2.3 实验所用到的菌株、质粒、载体和感受态细胞  29-30
    2.4 DNA的抽提和Southern杂交  30-31
    2.5 RNA的抽提、反转录和Northern杂交  31
    2.6 PCR、RT-PCR和Real-time PCR的检测  31
    2.7 水稻内源基因表达量分析的材料准备  31-32
    2.8 遗传转化载体的构建和转化  32-34
      2.8.1 超量表达载体的构建  32
      2.8.2 RNAi抑制表达载体的构建  32-34
      2.8.3 遗传转化  34
    2.9 铵盐转运子在酵母中的功能互补实验  34-35
    2.10 转基因植株的种植和性状考察  35-36
      2.10.1 水培试验和性状考察  35
      2.10.2 田间试验和性状考察  35-36
    2.11 转基因植株生理生化指标的测定  36
      2.11.1 游离NH_4~+含量的测定  36
      2.11.2 总氮含量的测定  36
    2.12 OsAMT2;3转基因植株~(15)N吸收实验  36
    2.13 酵母互补实验  36-37
  3 结果与分析  37-53
    3.1 目的基因的遗传转化和表型筛选  37-41
      3.1.1 目标基因的分离和遗传转化载体的构建  37-38
      3.1.2 遗传转化和转基因植株的阳性检测  38-39
      3.1.3 转基因植株的拷贝数和表达量检测  39
      3.1.4 T_1代转基因植株苗期水培筛选与鉴定  39-41
      3.1.5 T_2代转基因植株大田表型筛选  41
    3.2 水稻中铵盐转运子OsAMT基因分离及功能鉴定  41-53
      3.2.1 水稻OsAMT基因家族成员在27个组织或器官中的表达谱  41-44
      3.2.2 氮饥饿条件下铵盐转运子基因的表达水平  44-45
      3.2.3 不同氮源处理条件下铵盐转运子基因的表达水平  45-47
      3.2.4 铵盐转运子OsAMT2;1的功能分析  47-49
      3.2.5 铵盐转运子OsAMT2;3的功能分析  49-51
      3.2.6 铵盐转运子OsAMT2;1的功能分析  51-53
  4 讨论  53-57
    4.1 关于AMT基因功能的探讨  53-56
      4.1.1 铵盐转运子表达分析  53-54
      4.1.2 铵盐转运子的调节机制  54-55
      4.1.3 转基因表型的探讨  55-56
    4.2 关于后续工作的设想  56-57
第二章水稻OsRHC基因家族分析  57-81
  5 文献综述  57-59
    5.1 锌指蛋白概述  57
    5.2 C3HC4型的锌指蛋白属于RING型锌指蛋白  57-58
    5.3 C3HC4型锌指蛋白功能  58
    5.4 C3HC4型锌指蛋白最新研究进展  58-59
  6 本研究的目的与意义  59-60
  7 材料和方法  60-61
    7.1 数据库搜索  60
    7.2 蛋白结构域的分析和亚细胞定位  60
    7.3 启动子序列分析  60
    7.4 芯片表达谱分析  60-61
    7.5 植株生长培养和胁迫实验  61
    7.6 Real-time PCR半定量分析  61
  8 结果与分析  61-78
    8.1 水稻中OsRHC家族成员  61-65
    8.2 系统发生树分析  65-66
    8.3 蛋白结构域分析  66-69
    8.4 顺式作用元件的分析  69
    8.5 水稻不同组织和器官中OsRCH基因的表达  69-72
    8.6 激素处理下OsRCH基因的表达变化  72-75
    8.7 OsRCH基因在不同逆境条件下的表达变化  75-78
  9 讨论  78-81
    9.1 OsRCH基因在各种生理过程中发挥多种不同功能  78
    9.2 OsRCH基因启动子区段顺式作用元件揭示了OsRCH基因的功能  78-79
    9.3 激素对OsRCH基因的调节  79-80
    9.4 OsRCH基因在逆境反应中的重要作用  80
    9.5 OsRCH基因在生殖组织或器官中特异表达  80
    9.6 小结  80-81
参考文献  81-92
致谢  92-93
附录A 基本实验操作步骤  93-103
附录B 个人简历  103-104

低氮诱导表达基因、氮转运基因的功能研究以及水稻OsRHC基因家族分析

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