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荷斯坦母牛乳房炎相关基因多态性研究及其与体细胞评分的相关性分析
作 者: 郎咸政
导 师: 刘小林;储明星
学 校: 西北农林科技大学
专 业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 荷斯坦母牛 体细胞评分 基因型组合 乳房炎 SNPs
分类号: S858.23
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
本研究以265头中国荷斯坦母牛(第1胎82头、第2胎89头、第3胎94头)为研究对象,研究奶牛乳房炎相关的促破骨细胞因子1(osteoclast stimulating factor 1,OSTF1)基因、α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin ,α1-AT)基因、支架附着因子A(scaffold attachment factor A,SAF-A或heterogeneous nuclear ribonucleo protein U, HNRPU)基因和整合素β2 (integrin Bata2,ITGB2)基因的单链核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)及其与体细胞评分(somatic cell score,SCS)之间的关系,以期找到能够提高奶牛乳房炎抗性的遗传标记。采用PCR-SSCP结合测序技术分析OSTF1基因的单核苷酸多态性;采用PCR-SSCP技术以及结合测序结果采用PCR-RFLP和CRS-PCR技术对α1-AT基因第2、4外显子进行多态性检测;采用PCR-SSCP结合测序技术检测211头荷斯坦母牛HNRPU基因部分序列的多态性;采用PCR-RFLP技术对ITGB2基因进行多态性检测。用最小二乘法分析SNPs与SCS之间的关联性。获得了如下结果:1.扩增的OSTF1基因外显子7区域存在A45416G和C45436T 2个突变位点,其中A45416G突变位点导致蛋氨酸(M)变为缬氨酸(V)。经SSCP分析有AA、AB、BB、AC、CC 5种基因型,其频率分别为0.515、0.366、0.075、0.035、0.009。用最小二乘法分析OSTF1基因多态性与荷斯坦母牛体细胞评分(somatic cell score,SCS)的关系,结果表明:对于P3扩增产物多态位点,BB基因型SCS最小二乘均值显著低于AA、AB、AC基因型所对应的值(均为P<0.05);AA、AB、AC之间SCS最小二乘均值差异不显著(P>0.05)。对乳房炎抗性,AA是最不利基因型,BB是有利基因型。研究结果初步表明OSTF1基因A45416G多态位点的B等位基因对奶牛乳房炎有抗性。2.α1-AT基因第2外显子存在G5503A、G5746C两个同义突变。G5503A突变位点经PCR-RFLP检测发现3种基因型AA、AB和BB,其频率分别为0.3633、0.4644和0.1723。G5746C突变位点经CRS-RFLP检测发现3种基因型CC、CD和DD,其频率分别为0.3483、0.4906和0.1611。两个多态位点共出现了9种基因型组合,分别是AACC、AACD、AADD、ABCC、ABCD、ABDD、BBCC、BBCD和BBDD,它们的频率分别为0.2697、0.0899、0.0075、0.0749、0.3408、0.0412、0.0037、0.0599和0.1124。用最小二乘法分析α1-AT基因多态性与荷斯坦母牛SCS的关系,结果表明:BB基因型SCS最小二乘均值极显著低于AA和AB基因型(P<0.01),AB显著低于AA基因型(P<0.05);CC、CD、DD三种基因型SCS最小二乘均值差异不显著。基因型组合分析结果显示,BBDD基因型组合SCS最小二乘均值显著低于AACC和AACD基因型组合。对乳房炎抗性,AA是不利基因型,BB是有利基因型,AACC和AACD为不利基因型组合,BBDD为有利基因型组合。α1-AT基因的B等位基因和BBDD基因型组合对奶牛乳房炎有抗性。3. HNRPU基因的显子区域存在C7277T突变位点。扩增产物经SSCP分析有AA、AB、BB 3种基因型,其频率分别为0.3507,0.4408和0.2085。用最小二乘法分析HNRPU基因多态性与荷斯坦母牛体细胞评分(somatic cell score,SCS)的关系,结果表明:AA、AB和BB基因型之间SCS最小二乘均值差异均显著(P<0.05),SCS最小二乘均值的关系是BB<AB<AA。对乳房炎抗性,三个基因型中AA是最不利基因型,BB是最有利基因型。研究结果初步表明HNRPU基因C7277T多态位点的B等位基因对奶牛乳房炎有抗性。4. ITGB2基因检测到T18587C、G28301A两个突变。T18587C位点中AA、AB和BB的基因型频率分别为0.3517、0.4788和0.1695,A和B的基因频率分别为0.5911和0.4089;G28301A位点中CC、CD和DD的基因型频率分别为0.5678、0.3771和0.0551,C和D的基因频率分别为0.7564和0.2436。两个多态位点共出现了8种基因型组合,分别是AACC、AACD、ABCC、ABCD、ABDD、BBCC、BBCD和BBDD,它们的频率分别为0.2881、0.0636、0.2585、0.1991、0.0212、0.0212、0.1144、和0.0339。用最小二乘法分析ITGB2基因多态性与荷斯坦母牛体细胞评分的关系对于P5多态位点,SCS最小二乘均值的关系是BB<AB<AA,三者之间差异不显著;对于P15多态位点,SCS最小二乘均值的关系是DD<CD<CC,三者相互之间的差异均显著(P<0.05)。对乳房炎抗性,CC是最不利基因型,DD是有利基因型。基因型组合分析结果显示,8种基因型组合SCS最小二乘均值差异均不显著(均为P>0.05)。研究结果初步表明ITGB2基因G28301A多态位点的D等位基因对奶牛乳房炎有抗性。综上所述,荷斯坦母牛乳房炎相关基因多态性研究及其与体细胞评分的相关性分析认为OSTF1基因的B等位基因、α1-AT基因的B等位基因和BBDD基因型组合、HNRPU基因的B等位基因以及ITGB2基因的D等位基因都可以作为提高奶牛乳房炎抗性的遗传标记。
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全文目录
摘要 7-9 ABSTRACT 9-14 第一章 文献综述 14-20 1.1 奶牛乳房炎概述 14-16 1.1.1 乳房炎造成的损害 14 1.1.2 乳房炎的分类 14-15 1.1.3 乳房炎的发生 15 1.1.4 乳房炎的诊断 15-16 1.2 乳房炎抗性候选基因研究进展 16-19 1.2.1 促破骨细胞因子1(OSTF1)基因 16 1.2.2 α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)基因 16-17 1.2.3 支架附着因子A(SAF-A 或 HNRPU)基因 17-18 1.2.4 整合素β2 (ITGB2)基因 18-19 1.3 本试验的选题目的意义 19-20 第二章 材料与方法 20-26 2.1 实验材料 20 2.1.1 样本采集和处理 20 2.1.2 载体和菌株 20 2.1.3 主要试剂、仪器设备和溶液试剂配制 20 2.1.4 处理软件 20 2.2 实验方法 20-24 2.2.1 提取牛血样DNA 的步骤 20 2.2.2 DNA 浓度和纯度的检测 20-21 2.2.3 引物设计 21-23 2.2.4 PCR 扩增及检测 23 2.2.5 SSCP 分析 23 2.2.6 克隆测序并分型 23-24 2.2.7 RFLP 分析 24 2.3 数据处理 24-26 2.3.1 基因频率 24 2.3.2 基因型频率 24 2.3.3 基因型组合分析 24 2.3.4 群体杂合度 24 2.3.5 Hardy-Weinberg 平衡 24-25 2.3.6 多态信息含量 25 2.3.7 多态性与体细胞评分的相关性分析 25-26 第三章 结果与分析 26-38 3.1 荷斯坦牛OSTF1 基因的SNPs 及其与体细胞评分的关联性 26-27 3.1.1 PCR 产物 26 3.1.2 SSCP 检测 26 3.1.3 序列分析 26-27 3.1.4 OSTF1 基因的等位基因频率和基因型频率 27 3.1.5 固定效应对牛乳中体细胞评分的影响 27 3.2 荷斯坦牛α1-AT 基因SNPs 及其与体细胞评分的关联性 27-31 3.2.1 PCR 扩增 27-28 3.2.2 SSCP 检测 28 3.2.3 测序及多态 28 3.2.4 多态位点酶切检测 28-29 3.2.5 基因频率和基因型频率 29-30 3.2.6 基因型组合分析 30 3.2.7 荷斯坦奶牛α1-AT 基因多态性与体细胞评分的关系 30-31 3.3 荷斯坦牛HNRPU 基因SNPs 及其与体细胞评分的关联性 31-33 3.3.1 PCR 产物 31 3.3.2 SSCP 检测 31-32 3.3.3 序列分析 32 3.3.4 HNRPU 基因等位基因频率和基因型频率 32-33 3.3.5 固定效应对牛乳中体细胞评分的影响 33 3.4 荷斯坦牛ITGB2 基因SNPs 及其与体细胞评分的关联性 33-38 3.4.1 PCR 产物 33 3.4.2 测序分析 33-34 3.4.3 多态位点酶切检测 34-35 3.4.4 基因频率、基因型频率 35 3.4.5 基因型组合分析 35-36 3.4.6 荷斯坦奶牛ITGB2 基因多态性与体细胞评分的相关研究 36-38 第四章 讨论 38-42 4.1 提高PCR 扩增效率 38 4.1.1 保证模板质量 38 4.1.2 要重视引物设计 38 4.1.3 确保酶的活性 38 4.1.4 寻找最优的PCR 循环条件 38 4.2 选择正确的SNPs 检测方法 38-39 4.2.1 PCR-SSCP 方法 38-39 4.2.2 PCR-RFLP 和CRS-PCR 39 4.2.3 PCR 产物直接测序 39 4.3 荷斯坦母牛OSTF1 基因多态性及其与体细胞评分的密切关系 39 4.3.1 荷斯坦母牛OSTF1 基因多态性 39 4.3.2 荷斯坦母牛OSTF1 基因与体细胞评分的关系 39 4.4 荷斯坦母牛α1-AT 基因多态性及其与体细胞评分的密切关系 39-40 4.4.1 荷斯坦母牛α1-AT 基因多态性 39-40 4.4.2 α1-AT 基因与体细胞评分的关系 40 4.5 荷斯坦母牛HNRPU 基因多态性及其与体细胞评分的密切关系 40 4.5.1 荷斯坦母牛HNRPU 基因多态性 40 4.5.2 HNRPU 基因与体细胞评分的关系 40 4.6 荷斯坦母牛ITGB2 基因多态性及其与体细胞评分的密切关系 40-42 4.6.1 荷斯坦母牛ITGB2 基因多态性 40-41 4.6.2 荷斯坦母牛ITGB2 基因与体细胞评分的关系 41-42 第五章 结论 42-43 参考文献 43-48 附录 48-53 缩略词 53-54 致谢 54-55 作者简介 55
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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