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文蛤（Meretrix meretrix）不同壳色花纹品系的分子标记及DNA甲基化分析

作　者: 朱东丽
导　师: 王昭萍；林志华
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水生生物学
关键词: 文蛤壳色花纹品系 AFLP SSR DNA甲基化
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

文蛤(Meretrix meretrix)在我国南北沿海均有分布,属广温、广盐性滩涂埋栖型经济贝类,也是我国主要养殖贝类和出口水产品之一。培育抗病、抗逆和生长迅速的新品种是文蛤养殖业健康与可持续性发展的有效途径,而飞速发展的分子标记辅助育种技术为优良水产品种的快速培育提供了理论基础和实践指导。随着生物分子标记辅助育种技术的不断发展和完善,也出现了众多的亟待解决的问题,如选育群体的遗传多样性的维系和重要经济性状的遗传学分析等。本研究以文蛤4个壳色花纹选育品系(红壳(RS)、黑斑(BS)、细纹(TC)、暗纹(DF))为主要研究材料,利用AFLP、SSR分子标记技术及甲基化敏感多态性(MSAP)技术相结合对4个选育品系进行了遗传差异分析,为优良品种的选育及种质资源保护提供了理论基础和实践经验。所取得的主要研究结果如下:1.利用15对引物组合对4品系共128个个体进行了AFLP分析,共得到789个位点,总多态位点比例90.75%。Nei’s基因多样性和Shannon’s信息指数显示,4个品系的遗传多样性大小依次为BS品系>RS品系>DF品系>TC品系。AMOVA分析表明,79.45%的变异来自品系内,品系间的变异只占20.55%。聚类分析结果表明,4个品系间存在较明显的遗传差异,TC品系与其它品系的遗传差异最大,DF品系和RS品系的遗传差异相对较小。发现1个TC品系特有的AFLP标记,其出现频率为1.000,可作为品系鉴别的特征性标记。2. SSR分析结果表明,所选择的9个微卫星位点在所检测品系中都表现出了较好的多态性,9个微卫星位点在这4个品系中共检测到105个等位基因。等位基因数目最多的是WG07,共检测到21个等位基因,WG11检测到的最少,为7个等位基因。每个品系均具有特异等位基因类型,不同品系中相同微卫星位点的等位基因的分布规律不同。4个文蛤品系的多态信息含量(PIC)在0.433-0.834之间,观测杂合度的范围在0.110-1.000之间,期望杂合度的变化范围在0.486-0.867之间。Hardy-Weinberg平衡的卡方检测发现,大多数位点偏离平衡状态。两两品系之间的Fst值在0.005-0.269之间,两两品系间的遗传距离为0.0520-0.0980。3.应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对4个文蛤品系胞嘧啶甲基化模式和程度进行评估。结果表明,文蛤品系基因组的CCGG序列中检测到26.7%-30.0%的DNA发生甲基化,40对扩增引物筛出有9对显示有多态性,9对引物扩增共得到396条带,平均甲基化多态性(P)比率达19.6%。以上结果显示DNA甲基化在文蛤中发生频繁,且品系之间的甲基化模式存在差异,推测壳色花纹的不同可能与这些位点有关。本文首次运用MSAP技术对文蛤选育品系进行胞嘧啶甲基化分析表明,使用MSAP技术检测文蛤不同品系的多态性非常有效。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章综述  12-28
  1 文蛤的基本生物学特征及营养价值  12-13
    1.1 文蛤基本生物学特征  12
    1.2 营养价值  12-13
  2 文蛤遗传标记的研究进展  13-18
    2.1 形态标记  13-14
    2.2 细胞遗传标记  14-15
    2.3 生化遗传标记  15-16
    2.4 分子遗传标记  16-18
  3 AFLP、SSR 技术和 MSAP 技术及其应用  18-26
    3.1 AFLP 技术  18-21
    3.2 微卫星（SSR）技术  21-22
    3.3 AFLP、SSR 分子标记技术在海水养殖动物遗传学研究中的应用  22-24
    3.4 MSAP 技术及其应用  24-26
  4 本研究的目的和意义  26-28
第二章文蛤4 个壳色花纹品系的遗传差异分析  28-43
  1 材料与方法  28-34
    1.1 实验材料  28-29
    1.2 主要仪器设备  29-30
    1.3 主要试剂和药品  30
    1.4 主要溶液的配制  30-31
    1.5 DNA 的提取与纯度的检测  31
    1.6 AFLP 分析  31-34
    1.7 AFLP 引物筛选  34
    1.8 数据处理与分析  34
  2 结果分析  34-40
    2.1 基因组DNA 的检测结果  34-35
    2.2 预扩增结果  35
    2.3 选择性扩增结果  35
    2.4 AFLP 引物的筛选  35-36
    2.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果  36-37
    2.6 文蛤不同品系的AFLP 扩增位点数和遗传多样性  37
    2.7 4 个文蛤品系的AFLP 扩增带谱及特异性标记  37-38
    2.8 各品系间遗传分化程度  38-39
    2.9 遗传相似性系数、遗传距离及聚类分析  39-40
  3 讨论  40-43
    3.1 文蛤壳色花纹选育品系的遗传多样性  40
    3.2 贝类壳色花纹多态性与遗传的关系  40-41
    3.3 以壳色花纹为目标性状选育在贝类新品种培育中的应用  41-43
第三章文蛤微卫星引物的筛选及对不同品系的遗传分析  43-56
  1 材料和方法  43-45
    1.1 文蛤材料  43
    1.2 主要仪器  43
    1.3 主要试剂  43
    1.4 基因组DNA 的提取和检测  43
    1.5 文蛤微卫星引物的筛选  43-45
    1.6 数据统计与分析  45
  2 结果与分析  45-53
    2.1 PCR 引物筛选结果  45-46
    2.2 PCR 扩增产物琼脂糖检测结果  46
    2.3 PCR 扩增产物聚丙烯酰胺胶检测结果  46-47
    2.4 等位基因数(A_o)和有效位基因数(A_e)  47
    2.5 文蛤4 个品系中9 个微卫星位点的等位基因频率  47-50
    2.6 文蛤4 个品系的杂合度（H_o、H_e）和多态信息含量（PIC）  50-51
    2.7 微卫星位点的固定指数  51-52
    2.8 各微卫星位点的Hardy-Weinberg 平衡检验  52
    2.9 文蛤4 个品系间的遗传距离  52-53
    2.10 聚类分析  53
  3 讨论  53-56
    3.1 利用EST 文库筛选微卫星标记  53-54
    3.2 关于文蛤不同品系的遗传多样性分析  54
    3.3 海洋贝类壳色花纹的多态性  54-56
第四章文蛤4 个壳色花纹品系的 DNA 甲基化分析  56-63
  1 材料与方法  56-57
    1.1 文蛤材料  56
    1.2 主要仪器  56
    1.3 主要试剂  56
    1.4 基因组DNA 的提取和检测  56
    1.5 MSAP 分析  56-57
    1.6 数据统计与分析  57
  2 MSAP 结果分析  57-60
    2.1 MSAP 引物筛选结果  57
    2.2 4 个品系的甲基化水平  57-59
    2.3 4 个文蛤品系的甲基化多态性分析  59-60
  3 讨论  60-63
    3.1 MSAP 技术及在品种、品系的鉴定中的应用  60-61
    3.2 文蛤4 个品系基因组DNA 甲基化水平的初步分析  61-63
小结  63-65
参考文献  65-74
致谢  74-75
硕士就读期间已发表的论文及参加会议  75

文蛤（Meretrix meretrix）不同壳色花纹品系的分子标记及DNA甲基化分析

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