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长白山林蛙输卵管分泌细胞培养产物中糖蛋白的提取及特性研究

作　者: 徐鑫
导　师: 刘景圣
学　校: 吉林农业大学
专　业: 水产品加工及贮藏工程
关键词: 长白山林蛙输卵管分泌细胞糖蛋白的提取纯化定性分析
分类号: S966.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

长白山林蛙(Rana chensinensis Changbaishanensis)主要分布于我国东北长白山和小兴安岭地区,属于中国林蛙的一个亚种,有着重要的药用价值及滋补保健功能。其雌性动物输卵管排卵前的干品俗称林蛙油(蛤蟆油),是继人参、鹿茸之后的又一开发利用的滋补保健品,具有补肾益精,润肺养阴之功效。输卵管糖蛋白是由输卵管上皮细胞合成和分泌的一类特异性蛋白质,参与构成输卵管微环境,对配子受精前成熟、受精以及早期胚胎发育有重要的生殖生理作用,并不同程度地受体内多种激素调控。但关于长白山林蛙输卵管分泌细胞培养产物中糖蛋白的提取分离未见报道。本研究对长白山林蛙输卵管分泌细胞进行体外培养。用饱和度不同的硫酸铵分级盐析输卵管分泌细胞培养液的上清液,将培养液中的蛋白分离出后,用电泳的方法测定其为糖蛋白,最后用DEAE Cellulose-52阴离子交换柱层析及Sephadex G-100分子筛层析对分离出的糖蛋白进行纯化研究,得到糖蛋白的纯品,对其生物学特性进行研究,从而可以保护野生林蛙资源,在促进生态平衡,实现野生林蛙资源的可持续利用等方面都具有重要意义,同时也为人工生产林蛙油和生物制药提供可靠的试验依据。本论文主要研究内容及结果如下：1.长白山林蛙输卵管分泌细胞的培养采用剪切、撕碎法处理长白山林蛙输卵管组织。离心除去输卵管组织,收集其上清液放入包被好的培养瓶中在37℃培养箱中进行培养。当细胞长满培养瓶时,进一步扩大培养,收集其扩大培养后的细胞液。2.长白山林蛙输卵管分泌细胞培养产物中糖蛋白的分离纯化试验确定长白山林蛙输卵分泌细胞培养产物中糖蛋白盐析的最适硫酸铵饱和度为70%,此时生成的蛋白沉淀最多为0.3mg/100mg,收集盐析后沉淀离心,取其上清液,经SDS-PAGE电泳,确定其存在蛋白且分子量为116KDa,与长白山林蛙输卵管组织内腔冲洗液所含糖蛋白相同。采用等电聚焦电泳的方法测定糖蛋白的等电点(pI)结果为：p工为pH=5.2。然后采用DEAE Cellulose-52阴离子交换柱层析及Sephadex G-100分子筛层析对分离出的糖蛋白进行纯化,最后经SDS-PAGE电泳鉴定糖蛋白的纯度,且分子量为116KD。3.长白山林蛙输卵管分泌细胞培养产物中糖蛋白的定性分析结果(1)紫外全扫描：纯化后的样品在200nm-900nm波长范围进行紫外全扫描得出200nrm处有多糖特征峰,在280nm处有蛋白吸收峰,因而可以定性输卵管分泌细胞培养液中含糖蛋白；(2)红外全扫描：在4000-400 cm-1范围内进行红外全扫描定性输卵管分泌细胞培养液中含糖蛋白。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
1 前言  10-21
  1.1 长白山林蛙及林蛙油  10-12
    1.1.1 长白山林蛙的概述  10-11
    1.1.2 林蛙输卵管  11-12
  1.2 林蛙输卵管细胞的培养方法与分泌细胞的产物  12-13
    1.2.1 细胞的培养方法  12
    1.2.2 分泌细胞的培养产物  12-13
  1.3 输卵管分泌细胞培养产物中的糖蛋白  13-16
    1.3.1 糖蛋白的性质  13-15
    1.3.2 糖蛋白的生物学功能  15-16
  1.4 糖蛋白的应用及研究进展  16-17
    1.4.1 糖蛋白的应用  16-17
    1.4.2 糖蛋白的研究进展  17
  1.5 输卵管分泌细胞糖蛋白的提取与纯化  17-20
    1.5.1 输卵管分泌细胞糖蛋白的提取  17-18
    1.5.2 输卵管分泌细胞糖蛋白的纯化  18-20
  1.6 目的意义及研究内容  20-21
    1.6.1 目的意义  20
    1.6.2 研究内容  20-21
2 材料与方法  21-28
  2.1 材料  21
    2.1.1 试验样本  21
    2.1.2 试剂  21
    2.1.3 仪器及设备  21
  2.2 方法  21-28
    2.2.1 长白山林蛙输卵管分泌细胞的培养  21-22
    2.2.2 长白山林蛙输卵管分泌细胞培养产物中糖蛋白的提取  22-25
    2.2.3 长白山林蛙输卵管分泌细胞培养产物中糖蛋白的纯化  25-27
    2.2.4 长白山林蛙输卵管分泌细胞培养产物中糖蛋白的定性分析  27-28
3 结果与分析  28-37
  3.1 长白山林蛙输卵管分泌细胞的形态  28
  3.2 输卵管分泌细胞培养液中蛋白及多糖的总含量的测定结果  28-37
    3.2.1 饱和硫酸铵盐析法对蛋白的特性检测结果  28-29
    3.2.2 蛋白质标准曲线  29
    3.2.3 葡萄糖标准曲线  29-30
    3.2.4 长白山林蛙分泌细胞培养液中总蛋白及总糖含量结果  30
    3.2.5 输卵管分泌细胞培养液中糖蛋白等电点(pI)的测定结果  30
    3.2.6 粗提物中蛋白的比较  30-32
    3.2.7 输卵管分泌细胞培养液中的糖蛋白纯化结果  32-35
    3.2.8 紫外全扫描结果  35-36
    3.2.9 红外全扫描结果  36-37
4 讨论  37-38
  4.1 长白山林蛙输卵管分泌细胞的培养产物  37
  4.2 糖蛋白的纯化方法  37
  4.3 糖蛋白的特性研究  37-38
5 结论  38-39
参考文献  39-43
附录  43-44
致谢  44-45
作者简历  45

长白山林蛙输卵管分泌细胞培养产物中糖蛋白的提取及特性研究

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