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酸类化合物杀线虫活性及作用机理研究

作　者: 刘丹丹
导　师: 段玉玺
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 线虫防治酸类化合物生理代谢基因克隆
分类号: S482.51
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文以南方根结线虫、大豆胞囊线虫和甘薯茎线虫为靶标,系统研究了酸类化合物杀线虫活性的构效关系和作用机理。明确了酸类化合物对线虫的生物活性,了解了酸类化合物对线虫的作用方式和线虫的生理代谢变化,并进一步从分子角度揭示了化合物对线虫的作用机理。取得了如下研究进展：1.明确了酸类化合物对靶标线虫的杀线虫活性,并在此基础上推测活性基团为COO-基团。供试酸类化合物对南方根结线虫、大豆胞囊线虫和甘薯茎线虫的生活能力有不同程度的抑制作用。其中甲酸、乙酸、丙酸等小分子酸对线虫毒性和卵孵化抑制作用相对较强。比较供试化合物的分子结构和对线虫的毒力效果,我们发现,分子量小,分子体积小的化合物对线虫的作用能力强,而分子量大或分子体积大的化合物对线虫的作用弱。酸性基团COO-多的化合物相对于COO-少的化合物对线虫作用能力更强,如草酸等,CL-也表现出对线虫较高的抑制能力。多基团化合物和具有苯环或其它大基团的化合物,对线虫作用较弱。2.通过温室防效试验,测试了具有高杀线虫活性化合物的温室防治效果。试验结果表明,供试化合物都能够不同程度降低线虫的侵染能力。甲酸和丙酸对南方根结线虫防效以及对大豆胞囊线虫抑制率均达到70%以上；乙酸和草酸对南方根结线虫防效也较高,而对大豆胞囊线虫抑制率相对较低；柠檬酸和苹果酸对两种线虫都没有明显的防治效果。从寄主植物的生长情况来看,用草酸、柠檬酸和苹果酸处理的植株生长较好,甲酸、乙酸和丙酸处理的植株生长受到抑制。而且,草酸、柠檬酸、苹果酸对寄主植物种子和幼苗生长的影响较小。3.初步研究了高杀线虫活性化合物对线虫的作用方式。结果表明,线虫在受到酸类化合物作用后,其生活能力、运动行为、个体发育、体液渗透和形态等方面都发生了显著的变化。化合物处理线虫后,3种线虫的生活能力都明显降低,运动行为受到明显的抑制。线虫生长发育也受到很大影响,比如线虫体长缩短、口针增长,南方根结线虫和大豆胞囊线虫尾部透明区变长。同时供试化合物还促使线虫的体液外渗,在显微镜下线虫呈现出体内含物降解严重,线虫体中空,体壁萎缩等现象。4.了解了高杀线虫活性化合物对线虫生理代谢的影响。试验结果显示,线虫在受到酸类化合物作用后,其体内的总糖含量、糖原含量、可溶性蛋白含量及乙酰胆碱酯酶活性都出现降低趋势,甘油和氨基酸含量则呈升高趋势。5.克隆了南方根结线虫和大豆胞囊线虫的14-3-3蛋白基因,并首次获得大豆胞囊线虫14-3-3蛋白基因全长序列。采用反义PCR和RACE技术,从南方根结线虫和大豆胞囊线虫中克隆出14-3-3蛋白基因全长序列,分别为1525 bp和1027 bp。序列分析表明,南方根结线虫14-3-3蛋白基因含有一个开放阅读框架,编码261个氨基酸,大豆胞囊线虫14-3-3蛋白基因编码251个氨基酸,并且都含14-3-3蛋白家族保守结构域。同源性比对则再次证明了14-3-3蛋白基因具有高度的保守性。基因亚细胞定位分析预测表明,南方根结线虫和大豆胞囊线虫14-3-3蛋白基因可能在线虫的细胞质、细胞核、细胞骨架、线粒体、高尔基体、内质网和细胞膜等组织和器官都有分布。6.首次采用高通量数字化基因表达谱技术,分析了酸类化合物作用后大豆胞囊线虫基因表达变化。同时通过实时荧光定量PCR技术,明确了14-3-3蛋白基因的表达量变化情况。试验应用高通量数字表达谱技术,通过与参照基因和参照基因组的比对,在统计大豆胞囊线虫全部基因表达量的基础上,共筛选出酸作用下大豆胞囊线虫差异表达基因968个,并分别注释了差异基因的生物学功能、所处的细胞位置和参与的生物过程等特性。实时荧光定量PCR分析则表明,大豆胞囊线虫受到草酸作用后,14-3-3蛋白基因的相对表达量提高,达到未处理线虫的10.5倍。

全文目录

摘要  12-14
Abstract  14-17
前言  17-19
第一章植物线虫病害防治及14-3-3蛋白研究进展  19-48
  1.1 植物寄生线虫的危害和防治  19-33
  1.2 植物寄生线虫致病相关因子研究进展  33-37
  1.3 14-3-3蛋白研究进展  37-47
  1.4 展望  47-48
第二章酸类化合物对线虫活性构效关系研究  48-71
  2.1 材料与方法  49-56
  2.2 仪器设备  56
  2.3 数据分析  56-57
  2.4 结果与分析  57-69
    2.4.1 化合物对南方根结线虫2龄幼虫毒力影响  57-58
    2.4.2 化合物对大豆胞囊线虫2龄幼虫毒力影响  58-59
    2.4.3 化合物对甘薯茎线虫毒力影响  59-60
    2.4.4 化合物对南方根结线虫卵孵化影响  60-63
    2.4.5 化合物对大豆胞囊线虫卵孵化影响  63-67
    2.4.6 化合物对线虫趋性影响  67-69
  2.5 小结  69-71
第三章酸类化合物对植物寄生线虫温室防效及寄主生长影响  71-82
  3.1 材料与方法  71-75
  3.2 仪器设备  75
  3.3 数据分析  75
  3.4 结果与分析  75-80
    3.4.1 化合物对南方根结线虫温室防效影响  75-76
    3.4.2 化合物对大豆胞囊线虫温室防效影响  76
    3.4.3 化合物对番茄种子萌发影响  76-77
    3.4.4 化合物对大豆种子萌发影响  77-78
    3.4.5 化合物对番茄幼苗生长影响  78
    3.4.6 化合物对大豆幼苗生长影响  78-79
    3.4.7 化合物对南方根结线虫侵染影响  79
    3.4.8 化合物对大豆胞囊线虫侵染影响  79-80
  3.5 小结  80-82
第四章酸类化合物对植物寄生线虫作用方式影响  82-92
  4.1 材料与方法  82-83
  4.2 仪器设备  83-84
  4.3 数据分析  84
  4.4 结果与分析  84-90
    4.4.1 不同处理时间化合物对线虫生命活力影响  84-85
    4.4.2 化合物对线虫运动行为影响  85-86
    4.4.3 化合物对线虫个体发育影响  86-88
    4.4.4 化合物对线虫体液渗漏影响  88-89
    4.4.5 化合物处理线虫中毒症状观察  89-90
  4.5 小结  90-92
第五章酸类化合物对植物寄生线虫生理代谢影响  92-106
  5.1 材料与方法  92-100
  5.2 仪器设备  100
  5.3 数据分析  100-101
  5.4 结果与分析  101-104
    5.4.1 线虫体内糖含量分析  101
    5.4.2 线虫体内甘油含量分析  101-102
    5.4.3 线虫体内可溶性蛋白含量分析  102
    5.4.4 线虫体内全蛋白电泳分析  102-103
    5.4.5 线虫体内氨基酸含量分析  103-104
    5.4.6 线虫体内乙酰胆碱酯酶活性分析  104
  5.5 小结  104-106
第六章南方根结线虫和大豆胞囊线虫14-3-3蛋白基因克隆  106-131
  6.1 材料与方法  107-119
  6.2 仪器设备  119-120
  6.3 结果与分析  120-129
    6.3.1 线虫总RNA提取  120
    6.3.2 14-3-3蛋白基因片段扩增  120-121
    6.3.3 14-3-3蛋白基因全序列扩增  121-124
    6.3.4 基因信息学分析  124-129
  6.4 小结  129-131
第七章大豆胞囊线虫14-3-3蛋白基因RT-PCR和基因表达谱分析  131-157
  7.1 材料与方法  131-140
  7.2 仪器设备  140
  7.3 结果与分析  140-151
    7.3.1 Real Time PCR分析14-3-3蛋白基因相对表达量  140-142
    7.3.2 高通量数字化基因表达谱分析大豆胞囊线虫基因  142-151
  7.4 小结  151-157
第八章结论与讨论  157-161
  8.1 本论文取得的研究进展  157-159
    8.1.1 酸类化合物对植物寄生线虫活性构效关系  157
    8.1.2 酸类化合物对植物寄生线虫温室防效和寄主生长影响  157-158
    8.1.3 酸类化合物对植物寄生线虫作用方式影响  158
    8.1.4 酸类化合物对植物寄生线虫代谢影响  158-159
    8.1.5 南方根结线虫和大豆胞囊线虫14-3-3蛋白基因克隆  159
    8.1.6 大豆胞囊线虫14-3-3蛋白基因RT-PCR和基因表达谱分析  159
  8.2 本论文创新点  159-160
  8.3 讨论  160-161
参考文献  161-179
致谢  179-180
附录  180-181

酸类化合物杀线虫活性及作用机理研究

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