学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

RxLR效应分子协同互作控制大豆疫霉对寄主侵染过程

作　者: 王群青
导　师: 王源超
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆疫霉无毒基因 RxLR效应分子毒性功能表达模式多态性
分类号: S435.651
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
下　载: 221次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

大豆疫霉(Phytophthora sojae)引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性的病害之一,每年导致全球高达十几亿美元的直接经济损失。大豆疫霉是一类营半活体营养的病原卵菌,在侵染寄主的初期营活体营养,待成功侵入之后转入死体营养阶段。因此大豆疫霉的侵染过程中必然存在着复杂的分子机制来操纵植物的细胞死亡。目前的研究发现,大豆疫霉分泌的RxLR类效应分子如Avrlb等能够进入寄主细胞内,抑制植物的防卫反应,从而促进自身的侵入和扩展。生物信息学发现大豆疫霉基因组中RxLR家族效应分子有超过350个之多,如此众多的效应分子如何在大豆疫霉的致病过程中相互协调发挥作用目前还缺乏系统的研究。本研究通过对大豆疫霉RxLR类效应分子的转录谱的分析、抑制植物过敏性细胞死亡及与之相关关键氨基酸位点的功能筛选、不同生理小种间序列多态性分布等进行了多方面的研究,初步阐明了大豆疫霉RxLR家族效应分子在大豆疫霉致病过程中通过相互协调抑制植物防卫反应的机制。大豆疫霉RxLR类效应分子的程序化转录和功能相互作用抑制植物的防卫反应：本研究对170个RxLR效应分子的功能进行了初步分析。研究中发现虽然有少数效应分子(11个)能够直接激发植物的免疫反应,但有超过75%的效应分子对老鼠细胞凋亡前体蛋白Bax引起的植物细胞死亡具有抑制作用,而其中具有C端保守W结构域的RxLR效应分子对Bax触发的PCD(BT-PCD)具有更显著的抑制活性。系统比较分析了W结构域各氨基酸组成与抑制BT-PCD之间的关系,鉴定了8个与之相关的位点。而氨基酸位点突变实验证明位于W结构域第二个α螺旋的疏水性氨基酸与抑制BT-PCD的功能显著相关。研究中还发现RxLR效应分子的功能与其表达水平有显著关联,随着表达时间和表达丰度的积累,抑制BT-PCD的活性也随之增强。本文利用MicroArray数据对大豆疫霉的效应分子进行转录水平的研究,鉴定出20个在大豆疫霉侵染前期受诱导高量上调表达的效应分子。按照这些效应分子的表达丰度和转录调节进行划分,将其分为三种表达模式,即侵染前期表达量持续较高(][mmediately-Early effectors, IE)和侵染早期6-12h受诱导上调表达(Early effectors,E)以及虽然在前期诱导表达但是表达量和上调量都相对较低(Early-weak)三种表达模式。利用Real-time PCR对亲和互作中的效应分子表达模式进行验证,发现在不同菌株中的效应分子表达模式基本一致,推测这种表达模式是程序化的,可能与其功能实现有关。而利用大豆疫霉转化技术干扰两类表达量较高的效应分子中的关键基因Avh238和Avh172的转录水平,破坏其转录表达模式,则导致菌株致病力明显下降。说明这种程式化的转录模式一旦发生紊乱,就会影响菌株的毒性,同时也证明两类高表达的效应分子在侵染过程中都具有重要作用。对不同表达模式的效应分子的功能做进一步研究分析发现,E类的效应分子能够特异性抑制PAMP触发的植物免疫反应,而IE类效应分子则特别对效应分子触发的PCD有活性。两类效应分子分别针对植物免疫系统的不同层面,推测可能合作抑制植物防卫反应。本研究在烟草上成功模拟了两类效应分子的合作模式：卵菌的PAMP被植物的膜上受体识别激发PTI,诱导E类效应分子如Avh238在侵染前期高量上调表达,引起植物包括非寄主烟草和寄主大豆的PCD,而在侵染过程中一直表达量较高的Avh172则能够抑制Avh238引起的PCD,而两者的同时存在还能够抑制INF1以及MAPK信号通路在烟草上引发的过敏性细胞死亡,证明两类效应分子能够依靠功能互补来广泛抑制植物的防卫反应。本研究还发现Avh238在不同菌株中的等位基因存在着高度的序列多态性。其中来自菌株P7076的Avh238等位基因产物在烟草中的表达产物不能引起HR。功能实验则证明Avh238P7076能够抑制在烟草叶片上瞬时表达卵菌PAMP-INF1以及下游的MAPK信号通路所引起的HR反应。证明这种序列的多态性能够帮助RxLR效应分子逃避植物对其的识别作用,但不会影响其本身的毒性功能。对所有已知的无毒基因和两类在侵染中高表达的效应分子序列进行分析比较也发现,这种序列多态性在RxLR家族成员中普遍存在,说明其作为卵菌直接与植物互作的蛋白,面临着巨大的选择压力,所以进化速度非常快。而对Avh238的进一步研究发现,其蛋白序列第51及第76位氨基酸与其触发植物免疫反应显著相关,但这两个氨基酸并不位于已知的功能域上。说明这种序列的多态性能够帮助RxLR效应分子逃避植物对其的识别作用,但不会影响其本身的毒性功能。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
引言  12-14
上篇文献综述  14-65
  第一章植物与病原互作及植物免疫系统  15-43
    1 植物与病原菌互作  16-24
      1.1 植物R基因结构与功能  17-19
      1.2 病原菌无毒基因及其产物  19-20
      1.3 R基因和Avr基因互作  20-24
    2 植物免疫系统  24-33
      2.1 PAMPs触发的植物免疫反应(PAMP-triggered immunity,PTI)  24-26
      2.2 效应分子触发的免疫反应(Effector-Triggered immunity,ETI)  26-33
    参考文献  33-43
  第二章病原卵菌侵染机制和效应分子的研究进展  43-65
    1 卵菌(疫霉菌)的侵染机制  43-46
      1.1 疫霉菌的侵染循环  43-44
      1.2 疫霉基因组中的致病相关基因  44-46
    2 卵菌的无毒基因  46-54
      2.1 克隆的卵菌的无毒基因  47-52
      2.2 卵菌无毒基因的N端寄主锚定序列  52-54
    3 卵菌的RxLR家族效应分子  54-57
      3.1 疫霉基因组中RxLR效应分子的数量  54
      3.2 RXLR基因C端的保守结构  54-55
      3.3 RxLR基因C端的序列多样性  55
      3.4 RxLR基因的毒性功能  55-57
    参考文献  57-65
第一章大豆疫霉无毒基因的功能分析及研究体系建立  65-89
  1 材料和方法  68-74
    1.2 大豆疫霉菌丝基因组DNA的提取  69
    1.3 效应分子基因克隆及重组质粒的构建  69-70
    1.4 农杆菌GV3101感受态细胞的制备和转化方法  70-71
    1.5 抑制BT-PCD功能分析  71-72
    1.6 目的基因在烟草中的转录水平分析  72-73
    1.7 Western Blotting检测蛋白表达  73-74
  2 结果  74-83
    2.1 PVX病毒载体改造  74-75
    2.2 PVX病毒载体共表达系统的可操作性验证  75-77
    2.3 大豆疫霉无毒蛋白结构分析  77-78
    2.4 瞬时过量表达Avrlb抑制Bax诱导的HR反应  78-79
    2.5 系统表达Avrlb对烟草有毒害作用  79-80
    2.6 瞬时表达Avh331(Avr1k candidate)抑制Bax触发的烟草细胞死亡  80-81
    2.7 系统表达Avh331(Avr1k candidate)对烟草的毒性作用  81-82
    2.8 瞬时表达Avrla和Avr3a可抑制Bax触发的烟草细胞死亡  82-83
  3 讨论  83-85
  参考文献  85-89
第二章大豆疫霉RxLR效应分子的毒性功能分析  89-113
  1 材料和方法  92-95
    1.1 供试烟草和供试菌株的保存和培养  92
    1.2 效应分子基因克隆及重组质粒的构建  92-93
    1.3 效应分子的功能分析  93
    1.4 粒子轰击法表达效应分子  93-94
    1.5 RxLR效应分子W-motif各氨基酸的系统比较分析  94
    1.6 Avr1b及突变体酵母转化子对氧化压力的耐受性分析  94-95
    1.7 Avh5的W-motif关键氨基酸突变对BT-PCD抑制活性的影响  95
    1.8 Western Blotting检测蛋白表达  95
  2 结果  95-104
    2.1 RxLR效应分子的生物信息学分析  95-96
    2.2 RxLR效应分子抑制Bax触发的PCD的功能筛选  96-97
    2.3 部分效应分子能够诱导烟草细胞死亡  97-98
    2.4 10个效应分子能够在大豆上引起细胞死亡  98
    2.5 RxLR效应分子的W-motif与抑制植物细胞死亡的功能有关  98-100
    2.6 Avr1b的W-motif与抑制真核生物细胞死亡的功能有关  100-101
    2.7 系统比较分析W-motif与抑制BT-PCD相关的氨基酸  101-102
    2.8 Avh5的W-motif第二个α螺旋与抑制BT-PCD的功能有关  102-104
  3 讨论  104-106
  参考文献  106-113
第三章大豆疫霉通过程序化转录调控RxLR效应分子协同互作抑制植物防卫反应  113-153
  1 材料和方法  116-121
    1.1 供试菌株、培养基制备  116
    1.2 用于MicroArray及qRT-PCR分析的大豆疫霉侵染阶段样品处理  116
    1.3 RNA的提取  116-117
    1.4 Microarray分析  117
    1.5 Real-Time PCR分析  117
    1.6 烟草中瞬时表达效应分子  117-118
    1.7 Avh238同源基因功能验证  118
    1.8 质粒构建和大豆疫霉转化  118-120
    1.9 大豆疫霉基因瞬时沉默  120
    1.10 突变体的表型分析  120-121
  2 结果  121-140
    2.1 从MicroArray数据库中获得20个效应分子的表达数据  121-123
    2.2 RxLR效应分子的表达模式  123-124
    2.3 Real-Time PCR验证RxLR效应分子的表达模式  124-126
    2.4 两类效应分子作用于植物免疫反应的不同层面  126-128
    2.5 E类效应分子作用于PAMP触发的植物免疫反应  128-131
    2.6 IE类效应分子作用于效应分子及抗病蛋白触发的植物免疫反应  131-134
    2.7 两类效应分子之间存在着合作来共同抑制植物的防卫反应  134-135
    2.8 破坏E类效应分子Avh238的转录模式会影响致病力  135-138
    2.9 破坏IE类效应分子Avh172的转录模式同样会影响致病力  138-139
    2.10 瞬时沉默IE类效应分子导致致病力下降  139-140
  3 讨论  140-143
  参考文献  143-153
第四章效应分子操纵植物防卫反应的策略  153-177
  1 材料和方法  156-157
    1.1 供试烟草和供试菌株的保存和培养  156
    1.2 基因克隆、质粒构建及农杆菌转化  156
    1.3 效应分子抑制植物PCD功能筛选  156
    1.4 Avh238突变体构建  156
    1.5 瞬时表达目的蛋白  156-157
  2 结果  157-168
    2.1 RxLR效应分子在不同生理小种中存在序列多态性  157-159
    2.2 效应分子Avh172和Avh238具有高水平的多态性  159-160
    2.3 Avh238基因多态性使其逃避了寄主的识别,但不影响其毒性功能  160-161
    2.4 Avh238第69位到82位氨基酸是触发HR的关键区域  161-162
    2.5 Avh238第82-122位氨基酸区域是抑制INF1-PCD的关键部分  162-163
    2.6 Avh238在120-134区域的点突变不影响其触发烟草细胞HR  163-165
    2.7 Avh238第51位和76位氨基酸是触发烟草HR的关键氨基酸  165-166
    2.8 效应分子Avh238在植物细胞中无明确定位  166-167
    2.9 效应分子Avh238在植物细胞核中被识别触发植物免疫反应  167-168
  3 讨论  168-172
  参考文献  172-177
附录  177-209
全文总结及创新点  209-211
攻读博士学位期间发表的研究论文  211-213
致谢  213

RxLR效应分子协同互作控制大豆疫霉对寄主侵染过程

内容摘要

全文目录

相似论文