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马铃薯晚疫病水平抗性相关基因StPRp27和POTHR-1的功能分析

作　者: 史晓蕾
导　师: 谢从华
学　校: 华中农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 马铃薯 晚疫病 StPRp27 POTHR-1 病毒介导的基因沉默 基因功能
分类号: S435.32
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界上第四大粮食作物,在工农业生产中占有重要地位。由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是马铃薯生产中最为严重的病害,在世界各地频繁发生。马铃薯对晚疫病的抗性分为垂直抗性和水平抗性,由于晚疫病原菌小种变异迅速,容易产生新的强致病力生理小种,从而由主效基因控制的垂直抗性不持久。而由多基因控制的水平抗性,属于非小种专化抗性,对不同的晚疫病生理小种都具有抗性,抗性较为持久、稳定。目前,研究人员已开展了与水平抗性相关QTL位点的定位以及差异表达基因分离、鉴定等工作,初步揭示了参与水平抗性的相关基因,并对这些基因在晚疫病菌侵染期间的表达模式以及参与的防卫代谢途径进行了研究。在晚疫病菌诱导表达的相关基因中,病程相关蛋白基因StPRp27基因和一个与过敏反应相关的POTHR-1基因,在受到机械伤害、渗透胁迫、以及茉莉酸等处理时,均可被诱导表达。因此推断这两个基因参与了马铃薯晚疫病的防御反应,但作用机制尚不清楚。本研究通过功能分析探索其在抗性途径中的作用,取得的主要研究结果如下：1、在本氏烟草上瞬时超量表达StPRp27和POTHR-1,同时设置阳性对照Rpi-R3a(对晚疫病生理小种99189表现垂直抗性)和Rpi-sto(对晚疫病生理小种PY23表现为垂直抗性),阴性对照为对这两个晚疫病生理小种均无抗性的R基因(abpt)。对瞬时超量表达以上基因的叶片接种晚疫病进行抗性鉴定,结果发现超量表达StPRp27和POTHR-1的叶片对不同的晚疫病生理小种的抗性均有一定的提高,初步证明StPRp27和POTHR-1基因与晚疫病抗性有关。2、以含有R基因(Rpi-blb1或Rpi-blb2)的转基因本氏烟草和马铃薯野生种为宿主材料,利用病毒介导的基因沉默体系(virus-induced gene silencing,VIGS)分别对StPRp27和POTHR-1基因的功能进行缺失,随后通过晚疫病菌的接种鉴定以及利用R基因与病原菌效应子互作的实验证明,沉默StPRp27和POTHR-1基因后并不影响以Rpi-blb1和Rpi-blb2介导的对晚疫病抗性以及过敏反应的发生,证明StPRp27和POTHR-1所介导的抗性属于独立于主效基因Rpi-blb1和Rpi-blb2的抗性系统。3、构建CaMV 35S启动子驱动的StPRp27超量表达载体和干涉载体,转化鄂马铃薯3号(E3)品种,对得到的转基因株系进行StPRp27表达量分析显示,超量表达株系中StPRp27的表达量明显高于对照,特异干涉转基因株系中的表达量低于对照中的表达量。选取部分转基因株系接种晚疫病原菌进行抗性评价,结果显示超量表达StPRp27基因后转基因株系的抗晚疫病能力较对照显著提高,而沉默StPRp27基因的转基因株系抗病性与对照无显著差异,证明StPRp27基因参与了马铃薯晚疫病抗性调节,其机制可能与转录后的调控有关。4、构建pGEX-StPRp27重组载体,将该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,并对GST-StPRp27融合蛋白进行纯化,通过抑菌实验发现该融合蛋白对晚疫病菌孢子囊的萌发有一定的抑制作用,该基因可能处于马铃薯抗病信号系统的下游。构建StPRp27-GFP融合基因的表达载体,利用基因枪法转化洋葱内表皮细胞,研究结果发现,StPRp27-GFP融合基因在胞内表达,胞外和细胞壁上没有检测到绿色荧光。说明StPRp27蛋白可能在细胞内发挥抑菌作用。将用于构建马铃薯高密度图谱(UHD)的二倍体亲本材料SH83-92-488 (SH).RH89-039-16(RH)以及它们的F1代群体为材料,利用CAPS标记分别将StPRp27和POTHR-1基因定位在Ⅰ号和X号染色体上。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略词表  12-14
第一章 文献综述  14-40
  1.1 晚疫病概述  15-17
    1.1.1 病原菌特性  15-16
    1.1.2 晚疫病症状  16-17
    1.1.3 晚疫病的危害及防治  17
  1.2 植物的抗性机制  17-19
    1.2.1 非专化抗性  18-19
    1.2.2 专化抗性  19
  1.3 马铃薯晚疫病抗性机制  19-25
    1.3.1 以R基因介导的垂直抗性  20-23
    1.3.2 水平抗性  23-25
  1.4 病程相关蛋白基因研究概况  25-29
    1.4.1 病程相关蛋白与植物系统获得抗性和诱导系统抗性的关系  26-27
    1.4.2 病程相关蛋白基因的分类  27
    1.4.3 PR蛋白的分泌与分布  27-28
    1.4.4 病程相关蛋白PR-17家族成员的研究进展  28-29
  1.5 植物基因功能研究策略  29-38
    1.5.1 基因功能缺失的方法  30-36
    1.5.2 超量表达目的基因的方法  36-38
  1.6 本研究的目的、意义和主要内容  38-40
第二章 材料与方法  40-47
  2.1 植物材料  40
  2.2 病原菌繁育及离体叶片接种鉴定  40-41
    2.2.1 黑麦培养基繁育法  40-41
    2.2.2 块茎薄片繁育法  41
    2.2.3 离体叶片接种晚疫病原菌  41
  2.3 大肠杆菌及农杆菌感受态细胞的制备及转化  41-42
  2.4 瞬时超量表达体系及病毒介导的基因沉默体系的配制  42-43
    2.4.1 实验所用试剂的配制方法  42
    2.4.2 农杆菌悬浮液的配制及叶片注射  42-43
  2.5 农杆菌介导的马铃薯试管薯的遗传转化及转基因株系的鉴定  43-47
    2.5.1 杆菌介导的马铃薯试管薯的遗传转化方法  43
    2.5.2 基因组DNA抽提  43-45
    2.5.3 总RNA抽提及mRNA分离  45-47
第三章 初步验证StPRp27和POTHR-1基因功能  47-57
  3.1 前言  47
  3.2 材料和方法  47-50
    3.2.1 植物材料及晚疫病生理小种  47-48
    3.2.2 质粒和菌株  48
    3.2.3 载体构建  48-49
    3.2.4 瞬时超量表达StPRp27和POTHR-1基因及晚疫病菌接种鉴定  49-50
    3.2.5 瞬时超量表达叶片中StPRp27和POTHR-1基因表达情况检测  50
    3.2.6 病情调查  50
  3.3 结果与分析  50-55
    3.3.1 镜检晚疫病菌生长活力  50-51
    3.3.2 pENTR-StPRp27和pENTR-POTHR-1载体构建  51-52
    3.3.3 pK7WG2-StPRp27和pK7WG2-POTHR-1载体构建  52-53
    3.3.4 瞬时超量表达叶片中StPRp27和POTHR-1基因的表达情况  53
    3.3.5 晚疫病原菌抗性鉴定结果  53-55
  3.4 结语  55-57
第四章 StPRp27和POTHR-1基因与R(Rpi-blbl,Rpi-blb2)基因介导抗性的关系  57-70
  4.1 前言  57
  4.2 材料和方法  57-60
    4.2.1 植物材料以及晚疫病生理小种  57-58
    4.2.2 质粒和菌株  58
    4.2.3 载体构建  58-59
    4.2.4 TRV病毒载体侵染转基因本氏烟草及马铃薯野生种  59
    4.2.5 晚疫病菌的接种鉴定及病情监测  59
    4.2.6 R基因与Avr基因的识别反应  59-60
    4.2.7 基因沉默后接种病原菌的叶片中基因表达情况检测  60
  4.3 结果与分析  60-68
    4.3.1 TRV2-StPRp27和TRV2-POTHR-1载体构建  60-62
    4.3.2 TRV-PDS病毒载体侵染本氏烟草和马铃薯野生种  62-63
    4.3.3 病原菌接种叶片后StPRp27和POTHR-1基因表达情况检测  63-64
    4.3.4 StPRp27和POTHR-1与R(Rpi-blb1,Rpi-blb2)基因介导抗性的关系  64-68
  4.4 讨论  68-70
第五章 StPRp27基因在马铃薯植株上进行功能确证  70-81
  5.1 前言  70
  5.2 材料和方法  70-74
    5.2.1 植物材料  70
    5.2.2 菌株和质粒  70-71
    5.2.3 表达载体的构建  71-73
    5.2.4 马铃薯的转化、再生和筛选  73
    5.2.5 转基因植株的检测及Southern检测  73-74
    5.2.6 转基因植株的接种鉴定及统计分析  74
    5.2.7 转基因植株中StPRp27基因的表达检测  74
  5.3 结果与分析  74-80
    5.3.1 干涉载体的构建  74-75
    5.3.2 转基因马铃薯植株的获得及Southern检测结果  75-77
    5.3.3 转基因植株的RT-PCR检测及晚疫病抗性鉴定  77-80
  5.4 结语  80-81
第六章 StPRp27基因的作用机理  81-99
  6.1 前言  81
  6.2 材料与方法  81-86
    6.2.1 StPRp27同源序列的搜索及蛋白质序列的多重序列比对  81
    6.2.2 StPRp27的原核表达  81-83
    6.2.3 StPRp27亚细胞定位  83-85
    6.2.4 StPRp27和POTHR-1基因的基因组定位  85-86
  6.3 结果与分析  86-97
    6.3.1 StPRp27编码蛋白质的预测和分析  86-87
    6.3.2 StPRp27基因的原核表达及对晚疫病孢子囊萌发的影响  87-91
    6.3.3 StPRp27基因的亚细胞定位  91-93
    6.3.4 StPRp27和POTHR-1全长基因的克隆及染色体定位结果  93-97
  6.4 小结  97-99
第七章 总讨论  99-103
  7.1 StPRp27在马铃薯晚疫病抗病反应过程中的作用  99-100
  7.2 POTHR-1在抗病反应过程中的作用  100-102
  7.3 不足与展望  102-103
参考文献  103-121
附录  121-122
致谢  122

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 薯类作物病虫害 > 马铃薯（土豆）病虫害
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