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柑橘黄龙病昆虫介体—柑橘木虱的研究及九里香感染黄龙病菌后的差减文库构建

作　者: 王辉
导　师: 王国平；易干军
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理
关键词: 柑橘 黄龙病菌 九里香 柑橘木虱 地高辛标记 抑制差减杂交 序列表达标签
分类号: S436.66
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


柑橘黄龙病,也称作青果病,是柑橘上最严重的病害之一。黄龙病防治至今还没有有效的根治方法。柑橘木虱(Diaphorina citri)是黄龙病唯一的传播媒介。九里香(Murrava paniculata)为芸香科植物九里香属植物,是柑橘木虱最喜食的植物之一,感染黄龙病后很少表现症状。九里香作为抗黄龙病材料已有研究,但关于九里香感染黄龙病菌后基因表达情况研究很少。本研究采集田间具有典型黄龙病症状的样品,并对样品嫁接进行室内生物学鉴定、PCR扩增确定柑橘黄龙病阳性样品。在室外自然条件下研究柑橘木虱对福建茶和芸香科植物的选择性,观察柑橘木虱在福建茶和九里香上的生活周期,并在室内条件下研究柑橘木虱不同龄期若虫和成虫的饥渴耐受时间。采用不同浓度海芋乙醇提取物处理柑橘木虱若虫和成虫,采用夹毒叶片法分别测定提取物对柑橘木虱致死率,研究海芋提取物对柑橘木虱的生物活性。比较九里香感染黄龙病的不同途径,找出最佳感染途径后,收集感染黄龙病的九里香作为研究材料,应用SSH方法构建了九里香感染黄龙病早期的差减cDNA文库,分离获得在黄龙病病程相关的相关的cDNA片段,从中筛选出与抗性相关的基因片段。利用高效热不对称PCR技术扩增感染黄龙病菌的九里香的STH-21的cDNA全长,旨在克隆九里香上与黄龙病相关蛋白的STH-21蛋白的全长定量检测表达情况。本文主要研究结果如下：柑橘木虱可在福建茶和九里香上生存繁殖,两者若虫历期和成虫历期差异较大,福建茶上若虫期(15.0-20d),成虫期(17-19d),对照九里香上分别是15.0～17.0d和20.0～23.0d,福建茶上生活周期和九里香上相近,福建茶上为39.0-44.0d,九里香为39.0-45.0d九里香上若虫发育为成虫成活率为16.9%。比九里香低。福建茶对柑橘木虱是一种可接受寄主而不是最适合的寄主.柑橘木虱对寄主选择性测定显示该虫在选择各寄主之间差异明显,最适寄主为黄皮和九里香,其次是柠檬,沙田柚、红江橙和椪柑差异不大,很少取食枳壳。耐饥渴能力测试结果表明,低龄若虫和高龄若虫在供水缺食物时平均存活时间分别为10.0～12.0h和39.0～40.0 h,成虫可存活69.0-75.0h；在缺水供食物的条件下,平均存活时间分别为8.0-8.8h和35.0-37.0h,成虫为48.0-50.0h,在缺水缺食物的情况下,平均存活为7.7-8.2 h和15.0-18.0左右,成虫为36.0-38.0h。水分能延长柑橘木虱存活时间,成虫的耐受能力强于若虫。海芋挥发性物质和不同浓度乙醇提取物毒杀效果表明：挥发性气体物质0.5h内对柑橘木虱有强效毒杀作用。各级浓度提取物乙醇溶液对柑橘木虱成虫和若虫均有不同程度的杀灭效果。10克/100mL对木虱才有很强的毒杀作用,3h时每组死亡的平均数量为9.3,7h后几乎全部死亡,校正死亡率分别为45.6%和98.4%。提取物浓度为5克/100mL时,3H和24h后每组的平均校正死亡率分别为23.5%和71.0%。随着浓度的降低到0.1克/100mL,平均校正死亡率分别为8.5%和11.5%基本失去了毒杀作用。采用汁液摩擦、注射和挤压法,接种2个月后不能在九里香植株体内检测到黄龙病菌；黄龙病阳性接穗红江橙(Citrus sinensis Osbeck)嫁接九里香能使黄龙病菌成功侵染九里香,但接穗不能抽芽。草地菟丝子(Cuscuta campestris)和虫媒柑橘木虱(Diaphorina citri)都能成功从阳性植株体内将黄龙病菌传播至九里香。柑橘木虱传“毒”效率结果显示：木虱在红江橙阳性植株上取食1.5h-2h就能携带黄龙病菌,病原从柑橘木虱传到健康的九里香上最短需要12h,单头木虱带菌就能使九里香成功感染黄龙病菌。温度对病原的传播效率有较大影响,气温高于35℃或低于15℃时,介体昆虫活力差,传播病原的效率较低,0℃温度下木虱几乎不传播病原。40-C时昆虫死亡率高,活力差。采用抑制差减杂交技术,构建了柑橘黄龙病菌侵染九里香后不同时段的混合样品SSH正向和反向文库。Nest-PCR结果表明,插入片段大小平均为400 bp大小从0.2 kb到lkb不等。通过反向Northern斑点杂交技术对两个差减文库中400个片段进行筛选(正向300个,反向100个),共获得了167个差异EST表达片段。其中黄龙病菌诱导寄主上调表达的基因115个,下调表达的基因52个。利用BLASTn和BLASTx对所得EST进行相似性分析,结果显示,目前在柑橘中报道的仅有10个,其它绝大部分来源于拟南芥、蓖麻属、和番茄等。在167个ESTs片段中,36%尚不能推断明确其功能,其余64%涉及抗病防御、转录、信号转导、能量、代谢、蛋白质合成等信号途径,提示黄龙病菌与寄主互作是一个多基因参与的过程。研究结果对认识黄龙病菌-寄主互作的分子机制和寻找抗病相关基因有理论与实践意义。半定量PCR用来检测文库中miraculin-like protein, sthp2-21 ubiquitin-conjugating enzyme 8, chlorophyll A/B binding protein片段感染黄龙病菌前期表达情况,结果显示,miraculin-like protein, sthp2-21, ubiquitin-conjugating enzyme8属于上调表达基因,chlorophyll A/B binding protein属于下调表达基因,获得了九里香病程相关蛋白STH21基因的cDNA全长序列。该基因与葡萄属(fragaria)的同源性为68%,与马铃薯pSTH-21基因核酸序列的同源性为67%,与其它植物的同源性为50%～60%。半定量RT-PCR分析表明,黄龙病菌感染两周后该基因的表达量达到高峰。

全文目录


摘要  9-12
Abstract  12-15
缩略词表  15-17
第一章 柑橘黄龙病研究进展  17-34
  1.1 前言  17
  1.2 发生、分布及危害  17-18
  1.3 黄龙病的症状  18-19
  1.4 病原的研究  19-21
    1.4.1 病原的分类  19
    1.4.2 名称变化  19
    1.4.3 黄龙病菌的培养  19-20
    1.4.4 病原的分子生物学研究进展  20-21
  1.5 黄龙病的寄主  21
  1.6 柑橘黄龙的诊断和鉴定  21-24
    1.6.1 田间诊断  21-22
    1.6.2 生物学鉴定  22
    1.6.3 组织化学鉴定  22-23
    1.6.4 血清学检测  23
    1.6.5 生化指标检测  23
    1.6.6 分子生物学检测  23-24
    1.6.7 定量PCR  24
  1.7 黄龙病的传播途径  24-25
  1.8 黄龙病的防治  25-27
    1.8.1 培育无病种苗,严格实施检疫  25-26
    1.8.2 严格防治柑橘木虱  26
    1.8.3 转基因  26-27
  1.9 柑橘木虱研究进展  27-30
    1.9.1 发生于分布  27
    1.9.2 寄主种类  27-28
    1.9.3 传病及与黄龙病的发生  28
    1.9.4 柑橘木虱生物学特性  28-29
    1.9.5 柑橘木虱的防治  29-30
      1.9.5.1 化学防治  29
      1.9.5.2 生物防治  29
      1.9.5.3 物理防治  29-30
  1.10 植物抗病性的表现与病程相关蛋白  30-31
    1.10.1 植物抗病性的表现  30
    1.10.2 病原相关蛋白在抗病中的作用  30-31
  1.11 差异表达基因筛选方法  31-32
  1.12 本研究的目的和意义  32-34
第二章 柑橘木虱的生物学特性  34-43
  2.1 前言  34-35
  2.2. 材料与方法  35-36
    2.2.1 材料  35
    2.2.2 柑橘木虱对福建茶的选择性  35
    2.2.3 取食喜好性测定  35-36
    2.2.4 柑橘木虱的耐饥渴能力测定  36
    2.2.5 乙醇提取物的毒杀活性测定  36
    2.2.6 数据统计分析  36
  2.3 结果与分析  36-40
    2.3.1 对福建茶的选择性  36-37
    2.3.2 寄主选择性  37-39
    2.3.3 柑橘木虱的耐饥渴能力  39
    2.3.4 海芋对柑橘木虱的毒杀作用  39-40
      2.3.4.1 海芋叶片组织对木虱的毒杀作用  39-40
      2.3.4.2 乙醇提取物的毒杀活性测定  40
  2.4 讨论  40-43
第三章 柑橘黄龙病菌侵染九里香不同方法研究  43-53
  3.1 前言  43
  3.2 材料与方法  43-47
    3.2.1 材料  43-44
    3.2.2 不同接种方法比较  44
      3.2.2.1 针刺、摩擦接种和挤压法  44
      3.2.2.2 嫁接传染  44
      3.2.2.3 菟丝子传播  44
    3.2.3 柑橘木虱传播及传毒效率测定  44-45
      3.2.3.1 获菌时间测定  45
      3.2.3.2 传菌时间测定  45
      3.2.3.3 传菌效率测定  45
      3.2.3.4 温度对传菌的影响  45
    3.2.4 不同的DNA提取方法比较  45-46
    3.2.5 PCR检测  46-47
  3.3 结果与分析  47-50
    3.3.1 田间症状调查和生物学鉴定  47
    3.3.2 不同方法提取的DNA效果比较  47
    3.3.3 室内生物学鉴定  47-48
    3.3.4 不同传染方法比较  48-49
    3.3.5 柑橘木虱传菌效率测定  49-50
  3.4 讨论  50-53
    3.4.1 黄龙病症状  50
    3.4.2 提取方法的比较  50-51
    3.4.3 接种方法的比较  51-53
第四章 九里香感染黄龙病菌后的差减文库构建  53-87
  4.1 前言  53-54
  4.2 材料与方法  54-64
    4.2.1 文库材料收集  54-55
    4.2.2 不同的RNA提取方法比较  55
    4.2.3  55-62
      4.2.3.1 mRNA分离  55-56
      4.2.3.2 第一链合成反应  56-57
      4.2.3.3 Rsa Ⅰ酶切  57
      4.2.3.4 接头连接  57-58
      4.2.3.5 差减杂交  58-59
      4.2.3.6 两次PCR选择性扩增  59-60
      4.2.3.7 差减文库生成  60-62
        4.2.3.7.1 感受态细胞的制备  60-61
        4.2.3.7.2 连接  61
        4.2.3.7.3 热击转化感受态细胞  61
        4.2.3.7.4 质粒DNA的提取  61-62
    4.2.4. 地高辛检测差异片段  62-64
      4.2.4.1 模板处理  62
      4.2.4.2 标记  62-63
      4.2.4.3 检测  63
      4.2.4.4 预杂交  63
      4.2.4.5 洗膜  63-64
      4.2.4.6 差异表达克隆选取  64
      4.2.4.7 序列同源性检索  64
  4.3 结果与分析  64-84
    4.3.1 不同RNA提取方法比较  64-66
    4.3.2 文库构建  66-68
      4.3.2.1 分离mRNA  66
      4.3.2.2 双链合成及酶切效果  66-67
      4.3.2.3 接头连接  67
      4.3.2.4 差减杂交  67
      4.3.2.5 文库的生成  67-68
    4.3.3 差异片段的地高辛检测  68-69
    4.3.4 差异表达片段的序列分析及功能分类  69-84
    4.3.5 差异表达片段的基因功能分类  84
  4.4 讨论  84-87
第五章 病程相关蛋白CDNA克隆及表达分析  87-95
  5.1 前言  87
  5.2 材料与方法  87-90
    5.2.1 材料准备  87
    5.2.2 不同的RNA提取方法比较  87
    5.2.3 半定量PCR检测差异片段表达  87-88
      5.2.3.1 目标片段检测  87-88
      5.2.3.2 半定量RT-PCR  88
    5.2.4 hiTAIL-PCR扩增cDNA全长  88-90
      5.2.4.1 高质量DNA的提取  88
      5.2.4.2 引物设计  88-89
      5.2.4.3 PCR扩增  89-90
  5.3 结果与分析  90-93
    5.3.1 九里香部分基因对黄龙病菌侵染的应答反应  90
    5.3.2 hiTAIL-PCR扩增STH蛋白cDNA全长和序列分析  90-93
  5.4 讨论  93-95
    5.4.1 半定量检测  93
    5.4.2 hiTAIL-PCR扩增  93
    5.4.3 PR蛋白与植物诱导抗性间的关系  93-95
参考文献  95-105
图版与说明  105-108
附录A:主要试剂及溶液的配制  108-110
附录B:差减文库所用接头和引物信息  110-111
附录C:PMD18-T载体信息  111-112
致谢  112-113
博士期间已发表或已接受的文章  113

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 柑桔类病虫害
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