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利用抑制消减杂交（SSH）技术筛选乙烯利诱导黄瓜茎尖雌性表达相关基因

作　者: 金晓霞
导　师: 秦智伟
学　校: 东北农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 黄瓜 雌性表达 SSH cDNA文库 ESTs 克隆
分类号: S642.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


黄瓜(Cucumis sativus L.)属葫芦科(Cucurbitaceae)中幼果带刺的栽培品种,以幼嫩的果实供食用,结果能力强,产量高。应振士等(1990)认为黄瓜是研究植物性别决定和性别分化的好材料。黄瓜为雌雄同株植物,性器官的败育发生在形态发生晚期,单性花的性别决定取决于植物个体的基因型与环境条件的相互作用。影响黄瓜性别的基因中起主要作用的是m、F和A基因。但不论作用多强,其表达也要受到其他基因和环境的影响。黄瓜的性别决定对植物生长调节剂处理非常敏感,适宜的植物生长调节剂处理可使黄瓜的性别向不同的方向转化。乙烯利(或乙烯)可使植株雌性化,乙烯的作用看来是明确而且关键性的,其作用位点是茎尖。并且许多因素可以影响植物生长调节剂对性别的作用,如处理时的发育时期,植物生长调节剂处理的浓度和处理次数,环境因素(特别是温度和光周期)等。虽然利用遗传分析已对黄瓜的性别决定遗传有一些了解,但有关性别基因作用的机理、细胞遗传以及植物激素(尤其是乙烯)是怎样参与调控性别决定过程等方面的研究尚少报道。因此,要用分子生物学的方法分离出有关的基因,仍需大量的工作。本研究以黄瓜雄性系品种D06103为试材,利用150 mg/L的乙烯利处理黄瓜两叶一心时期的茎尖,以处理组茎尖为Tester,对照组茎尖为Driver,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建性别决定时期乙烯利处理的黄瓜茎尖cDNA文库,筛选乙烯利诱导黄瓜雌性表达相关基因,并对文库筛选出的11个基因进行了表达分析。在此基础上利用电子克隆技术克隆出3个黄瓜雌性表达相关基因的cDNA全长,并分别对其组织特异性表达进行了研究。试验结果如下：1.确立了外源激素乙烯利对黄瓜两叶一心时期的诱雌效果最佳的浓度为150 mg/L,并且不同浓度的乙烯利对黄瓜第一雌花节位影响不显著,但是对植株上雌花占总花数的百分比影响差异显著。乙烯利诱导后黄瓜雌、雄花芽扫描电镜观察发现,雌花中的雄蕊发育后期受到抑制,而雄花发育正常。2.构建乙烯利诱导后黄瓜茎尖的SSH文库,经过反向Northern杂交后得到120个阳性克隆,利用CAP3软件进行聚类和拼接,获得乙烯利诱导后特异增强表达的UniESTs103个,其中包括14个Contigs和89个Singlets。在GenBank上进行同源比对后,发现其中有99条可以找到已知的同源序列,占全部EST的96.1%；4条没有显著匹配结果,占全部EST的3.9%。有73条ESTs功能已知,占全部ESTs的73.7%；26条功能未知,占全部EST的26.3%。利用GeneOntology进行功能分类发现除未知功能外,很多基因涉及新陈代谢(尤其是光合作用)还有蛋白质合成、细胞间通讯和能量代谢等过程。3.对文库筛选得到的部分基因进行组织特异性表达分析,根据分析结果推测乙烯信号转导相关基因CS-EBF1、胞内甲基化作用相关基因CS-SAHH、参与转录后调节基因CS-PPR以及光合作用相关基因CS-RBCL和CS-CAB8与黄瓜乙烯利诱导后的雌性表达密切相关。4.克隆了黄瓜CS-EBF1基因,并对其蛋白质结构进行了预测。基因编码区全长为1964bp,编码640个氨基酸。该基因与拟南芥中的EBF1基因有67%的核苷酸序列相似性。蛋白含有部分F-box保守区域和LRRs区。CS-EBF1基因的表达分析表明在根、茎、叶、茎尖都受到乙烯利的诱导表达,并且在雌花芽中表达强于雄花芽,推测其与黄瓜雌花发育密切相关。5.克隆了黄瓜CS-SAHH基因,并对其蛋白质结构进行了预测。基因编码区全长1545 bp,编码485个氨基酸。黄瓜CS-SAHH氨基酸序列与苜蓿的同源性为63%。该基因编码的蛋白有两个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。基因表达分析表明,其在乙烯利诱导的黄瓜茎尖中表达增强,而在雄花的雄蕊中表达弱于雌花的各个部位。推测甲基化修饰作用参与黄瓜雄蕊的发育。6.利用生物信息学手段克隆了黄瓜CS-P0基因,该基因开放读码区为791bp,编码237个氨基酸。该蛋白可能存在2个凝血因子C区域标记和2个表皮样生长因子位点标记。2个凝血因子结合位点表明其与能量代谢有关,表皮样生长因子位点则是底物的结合位点。对Cs-P0基因的表达分析表明,其在雌花发育初期的雌花芽和幼果中表达较强。

全文目录


摘要  10-12
Abstract  12-15
1 引言  15-33
  1.1 研究的目的和意义  15-16
  1.2 主要研究内容和技术路线  16-18
    1.2.1 主要研究内容  16-17
    1.2.2 研究的技术路线  17-18
  1.3 国内外研究进展  18-30
    1.3.1 黄瓜性别分化研究进展  18-20
    1.3.2 环境条件及外源生长物质对黄瓜雌花分化的影响  20-21
    1.3.3 乙烯的信号转导途径及研究进展  21-24
    1.3.4 乙烯对黄瓜雌性分化的影响  24-26
    1.3.5 SSH(抑制消减杂交)文库构建的原理及特点  26-29
    1.3.6 SSH(抑制消减杂交)技术在植物中的应用  29-30
  1.4 存在的问题及思路  30-33
2 材料与方法  33-56
  2.1 乙烯利对黄瓜的雌性效应研究  33-34
    2.1.1 田间调查  33
    2.1.2 雌雄花芽的电镜观察  33-34
  2.2 乙烯利诱导黄瓜茎尖的SSH文库构建  34-45
    2.2.1 试验材料  34-35
    2.2.2 试验方法  35-36
    2.2.3 抑制消减杂交  36-41
    2.2.4 PCR产物的纯化  41-42
    2.2.5 PCR产物克隆  42
    2.2.6 PCR筛选  42-43
    2.2.7 斑点杂交筛选  43-45
  2.3 文库筛选基因及乙烯信号转导基因的表达检测  45-47
    2.3.1 试验材料  45
    2.3.2 试验方法  45-47
  2.4 黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(CS-SAHH)的克隆及表达分析  47-51
    2.4.1 试验材料  47
    2.4.2 试验方法  47-51
  2.5 黄瓜EIN3-Binding F-box protein gene 1(CS-EBF1)基因的克隆及表达分析  51-53
    2.5.1 试验材料  51
    2.5.2 试验方法  51-53
  2.6 黄瓜酸性核糖体蛋白(CS-P0)基因的克隆及表达分析  53-56
    2.6.1 试验材料  53
    2.6.2 试验方法  53-56
3 结果与分析  56-97
  3.1 不同浓度乙烯利对黄瓜的雌性诱导效果  56-58
    3.1.1 150 mg/L乙烯利对两叶一心期黄瓜的诱雌效果最好  56-57
    3.1.2 乙烯利处理后抑制黄瓜雄蕊发育的扫描电镜观察  57-58
  3.2 黄瓜茎尖SSH差减文库构建  58-70
    3.2.1 总RNA的提取及mRNA的分离  58-59
    3.2.2 ds cDNA的合成及合成效率检测  59
    3.2.3 接头连接效率检测  59-60
    3.2.4 两次PCR扩增结果  60
    3.2.5 消减效率的PCR检测  60-61
    3.2.6 SSH产物克隆及文库质量评价  61-62
    3.2.7 菌液斑点杂交  62
    3.2.8 ESTs获得与分析  62-70
  3.3 文库筛选ESTs及乙烯信号转导相关基因的表达研究  70-75
    3.3.1 6个ESTs在植株不同部位的表达分析  70-72
    3.3.2 乙烯合成与信号转导相关基因的表达分析  72
    3.3.3 11个ESTs在茎尖中的表达分析  72-74
    3.3.4 11个ESTs在花芽中的表达分析  74-75
  3.4 S-腺苷-L高半胱氨酸水解酶基因cDNA全长的克隆及表达分析  75-85
    3.4.1 CS-SAHH基因编码区全长的获得  75-78
    3.4.2 CS-SAHH蛋白结构分析  78-82
    3.4.3 CS-SAHH基因的组织特异性表达分析  82-85
  3.5 EIN3-Binding F-box protein 1基因cDNA全长的克隆及表达分析  85-92
    3.5.1 CS-EBF1基因编码区全长片段的获得  85-87
    3.5.2 CS-EBF1蛋白结构分析  87-90
    3.5.3 乙烯利诱导后CS-EBF1基因的表达研究  90-92
  3.6 酸性核糖体蛋白(CS-PO)基因的克隆及表达分析  92-97
    3.6.1 CS-PO基因编码区全长片段的获得  92-93
    3.6.2 CS-PO蛋白结构分析  93-95
    3.6.3 CS-PO基因的组织特异性表达分析  95-97
4 讨论  97-105
  4.1 乙烯利对黄瓜雄性系的促雌效果  97
  4.2 利用抑制消减杂交(SSH)技术筛选乙烯利诱导黄瓜雌性表达相关基因  97-98
  4.3 黄瓜雌性表达相关基因的表达分析  98-99
  4.4 黄瓜雌性表达相关基因  99-103
    4.4.1 EIN3-Binding F-box protein 1基因(CS-EBF1)  99-101
    4.4.2 S-腺苷-L高半胱氨酸水解酶基因(CS-SAHH)  101-102
    4.4.3 酸性核糖体蛋白PO基因(CS-PO)  102-103
  4.5 本研究的创新与不足  103-105
    4.5.1 本研究的创新  103
    4.5.2 本研究的不足  103-105
5 结论  105-107
致谢  107-109
参考文献  109-119
附录  119-125
攻读博士期间发表的学术论文  125

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 瓜类 > 黄瓜
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