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microRNA在恒河猴子宫内膜中的表达及其对靶基因的调节

作　者: 刘极龙
导　师: 杨增明
学　校: 东北农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 子宫内膜接受性 microRNA 恒河猴小分子RNA深度测序 PGR lncRNA
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

子宫内膜接受性的建立是胚胎着床过程中的一个重要环节,受到很多因素的调控,许多基因参与其中。microRNA(miRNA)作为一类非编码小分子RNA在基因转录后调节过程中扮演着重要角色。但是miRNA与子宫内膜接受性的关系目前仍不清楚。本实验以恒河猴为动物模型,对月经周期第15天(接受前期)和月经周期第21天(接受期)的子宫内膜样品进行了小分子RNA深度测序。测序结果表明,恒河猴子宫内膜中至少表达326种已知的miRNA。与月经周期第15天相比,在月经周期第21天上调的miRNA有23个,下调的miRNA有88个。为了验证深度测序结果的可信性,我们选取了8个差异表达的miRNA进行real-time RT-PCR验证,这些miRNA的real-time RT-PCR结果与深度测序结果中的表达趋势均一致。另外,我们在深度测序结果中发现了112个潜在的新miRNA种类,其中11个与其它物种的miRNA有同源性。为了分析差异表达miRNA的靶基因,我们还对月经周期第15天(接受前期)和月经周期第21天(接受期)的子宫内膜样品进行了基因表达标签测序。标签测序结果不但提供了基因表达的定量信息,还提供了子宫内膜特异的基因3’-UTR的终止位置信息。恒河猴子宫内膜中至少表达9 943种基因的mRNA,其中40%存在2个或2个以上的可变3’-UTR序列。我们发现子宫内膜中的孕酮受体(progesterone receptor,PGR)基因具有很长的(约10 000 bp)3’-UTR序列,同时我们还发现了一个长度约为2 500 bp的3’-UTR变体。我们用Northern blot和real-time RT-PCR均验证了这两个长度的3’-UTR的存在。通过基因组比对发现,恒河猴PGR的3’-UTR序列与人极为相似,但与啮齿类的序列同源性不高。利用TargetScan算法,我们发现PGR的3’-UTR上存在两个在接受期子宫内膜中上调的miRNA(miR-96和miR-375)的结合位点。荧光素酶分析显示,PGR确实是这两个miRNA的靶基因。miR-96与PGR的3’-UTR结合在恒河猴和人中是保守的,在小鼠中因为有3个碱基的错配而失去结合能力;而miR-375与PGR的结合则具有恒河猴特异性,在人和小鼠中因为分别有2个和3个碱基的错配而失去结合能力。此外,我们发现miR-219-5p也可以调节PGR基因的表达。miR-219-5p可以与PGR基因下游的一个长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)结合,进而间接调节PGR的表达。该lncRNA仅在恒河猴和人中保守,而在小鼠中缺乏同源序列。综上所述,我们筛选到一批与恒河猴子宫内膜接受性相关的miRNA。靶基因分析表明其中的一些miRNA参与PGR基因表达的调节。这种调节具有物种特异性。我们的结果为研究子宫内膜接受性的分子机理提供了新的线索。

全文目录

摘要  10-11
Abstract  11-13
1 引言  13-23
  1.1 胚胎着床的动物模型  13-14
  1.2 子宫内膜接受性的建立  14-16
    1.2.1 接受态子宫内膜腔上皮的形态学变化  14-15
    1.2.2 子宫内膜接受性的分子调控  15-16
  1.3 调节型非编码RNA 与胚胎着床  16-19
    1.3.1 miRNA 与胚胎着床  16-18
    1.3.2 长的非编码RNA 与胚胎着床  18-19
  1.4 高通量方法在胚胎着床研究中的应用  19-21
    1.4.1 转录组学方法  19-20
    1.4.2 高通量的miRNA 表达检测方法  20-21
    1.4.3 蛋白组学方法的应用  21
  1.5 研究的目的和意义  21-23
2 材料与方法  23-36
  2.1 实验动物与材料的收集  23
    2.1.1 实验动物  23
    2.1.2 材料的收集和保存  23
  2.2 小分子RNA 深度测序分析  23-25
    2.2.1 小分子RNA 文库构建与高通量测序  23-24
    2.2.2 测序结果分析  24-25
  2.3 基因表达标签测序  25-26
    2.3.1 基因表达标签文库的构建与高通量测序  25
    2.3.2 基因表达标签数据分析  25-26
  2.4 Real-time PCR  26-29
    2.4.1 RNA 提取  26
    2.4.2 miRNA 定量  26-27
    2.4.3 mRNA 定量  27-29
  2.5 RNA 杂交探针的制备  29-31
    2.5.1 引物设计  29
    2.5.2 组织中总RNA 提取与DNA 的消化  29
    2.5.3 反转录  29-30
    2.5.4 扩增及产物回收  30
    2.5.5 pGEM-T 载体的连接及转化  30-31
    2.5.6 目的片段的PCR 扩增  31
    2.5.7 地高辛标记 cRNA 探针  31
  2.6 Northern blot  31-34
    2.6.1 Northern blot 试剂配制  32
    2.6.2 RNA 提取  32-33
    2.6.3 琼脂糖凝胶电泳  33
    2.6.4 探针杂交  33
    2.6.5 杂交后洗涤和显影  33-34
  2.7 miRNA 靶基因3'-UTR 载体构建与荧光酶素活性分析  34-36
    2.7.1 miRNA 靶基因预测  34
    2.7.2 3'-UTR-载体的构建  34-35
    2.7.3 ECC-1 细胞转染  35
    2.7.4 荧光素酶活性的测定  35-36
3 结果  36-51
  3.1 小分子RNA 深度测序结果分析  36-44
    3.1.1 恒河猴子宫中小分子RNA 的组成  36-37
    3.1.2 已知的miRNA 的表达  37-39
    3.1.3 新发现的miRNA 的表达  39-40
    3.1.4 miRNA 的差异表达  40-44
    3.1.5 Real-time RT-PCR 验证  44
  3.2 基因标签测序结果分析  44-48
    3.2.1 差异表达基因的筛选  44-45
    3.2.2 real-time RT-PCR 验证  45-46
    3.2.3 基因3'-UTR 序列的鉴定  46-47
    3.2.4 PGR 的3'-UTR 变体的鉴定  47-48
  3.3 miRNA 对PGR 基因的调节  48-51
    3.3.1 潜在调节PGR 基因的miRNA  48
    3.3.2 miR-375 对PGR 的调节  48-49
    3.3.3 miR-96 对PGR 的调节  49
    3.3.4 miR-219-5p 对PGR 的调节  49-51
4 讨论  51-60
  4.1 子宫内膜 miRNA 表达谱  51-53
    4.1.1 miRNA 丰度的比较  51-52
    4.1.2 miRNA 表达差异的比较  52-53
  4.2 PGR 基因的3'-UTR 变体形式  53-54
  4.3 miRNA 可能通过 PGR 调节子宫内膜接受性  54-55
  4.4 miRNA 对靶基因调节的物种特异性  55-57
    4.4.1 物种特异的miRNA  55
    4.4.2 miRNA 结合位点的保守性  55-56
    4.4.3 3'-UTR 长度的变化  56-57
    4.4.4 lncRNA 的物种特异性  57
  4.5 lncRNA 作为miRNA 靶基因的潜力  57-60
    4.5.1 miRNA 调节lncRNA 的表达  57-58
    4.5.2 miRNA 通过 lncRNA 调节 PGR  58-59
    4.5.3 lncRNA 作为miRNA 靶基因的意义  59-60
5 结论  60-61
致谢  61-62
参考文献  62-73
图版  73-80
攻读博士期间发表的论文  80

microRNA在恒河猴子宫内膜中的表达及其对靶基因的调节

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