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白菜叶缘裂刻基因的精细定位及BcCUC基因克隆和功能分析

作　者: 惠麦侠
导　师: 张鲁刚
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 园艺植物种质资源学
关键词: 白菜 叶发育 基因定位 CUC基因 功能分析
分类号: S634
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


叶形极大的影响着植物的光合、产量、商品性状等,而叶缘形状在很大程度决定着叶形的多样性。定位和克隆白菜叶缘发育相关基因对白菜叶形发育机理及叶形性状的改良具有重要的意义。本研究从白菜‘矮抗青’自交系的叶缘裂刻变异株中选育了叶全缘(7B)和叶深裂(7H)两个重组近等基因系,观察了其形态学和组织学特征；构建了7B和7H株系的cDNA表达谱；开展了叶缘裂刻基因精细定位的研究；进一步克隆了白菜叶缘裂刻调控基因BcCUC1和BcCUC3,并分析了其在拟南芥中的功能,主要取得以下结果。1.以白菜叶缘裂刻近等基因系7B和7H为材料,采用叶脉透明和扫描电镜技术分析其组织学特征,采用Northern杂交和半定量RT-PCR技术,研究了叶缘裂刻发育相关基因和miRNA的表达,结果显示7H较7B叶缘有较深裂刻、叶面积减少；叶片一级叶脉数目减少但发育健壮；叶边界细胞小而圆、密集、处于未分化状态；基因STM,BP、JLO、CUC2、CUC3和miR319在7H中的表达被上调,同时AS1、AS2、HB8和miR164表达被下调,说明7H叶缘形状受众多基因的协同调控。2.应用cDNA-AFLP技术从mRNA表达水平研究白菜叶全缘和叶裂刻近等基因系间基因表达的差异。共获得57条差异片段,合并归属于55条非重复序列,其中在叶全缘株系中增强或特异表达的有25条,叶裂刻株系中增强或特异表达的有30条。54条差异片段可以在NCBI数据库中找到同源序列(包括EST),其中42条为已知基因,1条没有找到同源序列。按照其参与的生物学途径归类,已知基因片段参与了代谢、转录、细胞囊泡运输、蛋白质合成和降解、蛋白质储藏与运输、信号传导、光合系统、基因转座等相关过程。用AFLP转化的SCAR标记在分离群体上验证结果表明,SEL7B16-SCAR检测片段的表达模式与cDNA-AFLP结果一致。3.以裂刻性状分离的近等基因系群体为材料,采用集群分离分析法(bulked segregate analysis, BSA)筛选与裂刻基因连锁的分子标记,对裂刻基因进行定位。遗传分析表明近等基因系的裂刻性状由单显性基因控制,命名为BcLL1基因。采用BSA方法建立叶全缘和叶深裂的DNA混合池,筛选到4个与BcLL1基因紧密连锁的分子标记,并成功将其转化为SCAR标记。通过对分离群体筛选,BcLL1基因被限定在一个1.8 cM的区间。通过比较作图,BcLL1基因所在区间与拟南芥(Arabidopsis) 5号染色体短臂末端的一个268 kbp、大白菜第10号染色体的一个199 kbp区间建立共线性。研究结果将有助于BcLL1的图位克隆。4.采用基因同源克隆的方法获得了白菜基因BcCUC1,并转化拟南芥做了初步的功能鉴定。结果表明BcCUC1属于植物特异的NAC domain超家族的CUC亚家族成员。该基因编码区CDS长930 bp,编码309个氨基酸。基因结构分析显示BcCUC1由3个外显子和2个内含子组成。BcCUC1的氨基酸序列和碎米芥、拟南芥、筷子芥的CUC1蛋白一致性分别为79%、80%、80%。半定量RT-PCR分析发现BcCUC1在营养生长顶端、幼叶和花器官中均有表达。过表达BcCUC1的拟南芥转基因植株子叶表面产生异位的分生组织、子叶叶缘出现深裂,原位杂交显示这些表型与BcCUC1转录本的异位累积相一致。在培养基中添加细胞分裂素和生长素处理下,过表达BcCUC1拟南芥植株子叶上异位芽的数目急剧增加、真叶叶缘普遍产生深而多的裂刻、下胚轴部位诱导出大量的愈伤组织。这些表型的加重亦和激素诱导后BcCUC1转录本的增多一致。研究结果说明BcCUCl在植物分生组织的建成和叶缘发育过程中发挥着重要的作用。5.采用基因同源克隆的方法获得了白菜基因BcCUC3,并转化拟南芥做了初步的功能鉴定。研究结果表明,白菜BcCUC3的编码区CDS长1008 bp,编码335个氨基酸,基因结构分析显示BcCUC3包含3个外显子、2个内含子,具有典型的植物NAC domain结构域。BcCUC3编码区氨基酸序列与其它植物的CUC3蛋白有很高的一致性,尤其与甘蓝、萝卜、拟南芥CUC3蛋白高度一致,一致性分别达到98%,97%,83%,在不同物种CUC3的系统进化树上,BcCUC3归属于双子叶植物分支的十字花科亚组。BcCUC3在7H株系中表达远高于在7B中的表达。过表达BcCUC3的转基因拟南芥呈现叶缘出现裂刻、主枝和侧枝增加的新表型。说明该基因参与叶形和腋生花序组织的发育调控。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-14
第一章 文献综述  14-28
  1.1 植物叶缘发育分子机理研究进展  14-21
    1.1.1 植物叶缘性状的分类及其生物学功能  14-15
    1.1.2 植物叶的起始与叶缘发育  15
    1.1.3 植物叶缘发育相关的基因  15-18
    1.1.4 激素与植物叶缘发育  18-20
    1.1.5 miR164和miR319与植物叶缘发育  20-21
  1.2 植物CUC亚家族转录因子研究进展  21-25
    1.2.1 CUC转录因子的结构与功能机制  21-23
    1.2.2 CUC基因参与植物边界形成  23
    1.2.3 CUC参与SAM起始和子叶的分离  23-24
    1.2.4 CUC基因参与叶缘裂刻和复叶发育  24-25
    1.2.5 CUC参与侧枝和花发育  25
  1.3 植物叶缘裂刻基因QTL定位和克隆研究进展  25-27
    1.3.1 叶缘裂刻性状的遗传分析研究  26
    1.3.2 叶缘裂刻基因的QTL定位及图位克隆  26-27
  1.4 本研究目的和意义  27-28
第二章 白菜叶缘裂刻近等基因系的选育、形态观察及叶缘发育相关基因的表达分析  28-39
  2.1 材料  28
  2.2 方法  28-32
    2.2.1 近等基因系选育  28
    2.2.2 表型特征观察  28
    2.2.3 叶脉透明及观察  28-29
    2.2.4 扫描电镜观察(Scanning electron microscopy,SEM)  29
    2.2.5 叶缘裂刻相关基因的半定量RT-PCR检测  29-31
    2.2.6 Northern杂交  31-32
  2.3 结果与分析  32-37
    2.3.1 白菜叶缘裂刻近等基因系的选育  32-33
    2.3.2 白菜叶缘裂刻近等基因系7B和7H的叶表型比较  33-34
    2.3.3 白菜叶缘裂刻近等基因系7B和7H叶脉模式比较  34-35
    2.3.4 白菜叶缘裂刻近等基因系7B和7H叶缘细胞特征  35-36
    2.3.5 白菜近等基因系7B和7H中叶缘发育相关基因及miRNA的表达分析  36-37
  2.4 讨论  37-39
第三章 白菜叶缘裂刻近等基因系的cDNA-AFLP分析及SCAR标记的转化  39-48
  3.1 材料  40
  3.2 方法  40-41
    3.2.1 总RNA的提取和双链cDNA合成  40
    3.2.2 cDNA-AFLP分析  40
    3.2.3 差异表达片段回收、测序与生物信息学分析  40-41
    3.2.4 差异片段转化为SCAR标记  41
  3.3 结果  41-45
    3.3.1 DLL7H的cDNA-AFLP分析  41-42
    3.3.2 差异片段的序列分析及测定  42-44
    3.3.3 差异片段功能分析  44-45
    3.3.4 AFLP差异来源分析与SCAR标记的转化  45
  3.4 讨论  45-48
    3.4.1 cDNA-AFLP在基因差异表达中的可靠性  45-46
    3.4.2 差异表达基因与叶缘裂刻发生的可能关系  46
    3.4.3 近等基因系对研究叶缘裂刻基因表达差异的影响  46-48
第四章 白菜叶缘裂刻性状基因BcLL1的定位  48-58
  4.1 材料  48
  4.2 方法  48-51
    4.2.1 表型观测  48-49
    4.2.2 基因型分子检测  49-51
    4.2.3 遗传作图  51
  4.3 结果  51-56
    4.3.1 叶缘裂刻性状的遗传分析  51-53
    4.3.2 SRAP,ISSR and cDNA-AFLP-derived标记的SCAR转化  53-54
    4.3.3 BcLL1基因的定位  54-55
    4.3.4 BcLL1区域和拟南芥、大白菜相应区域的共线性分析  55-56
  4.4 讨论  56-58
第五章 白菜BcCUC1基因的克隆及其诱导拟南芥子叶上形成SAM的功能  58-78
  5.1 材料  59-60
    5.1.1 植物材料  59
    5.1.2 菌株与质粒  59
    5.1.3 酶和生化试剂  59-60
  5.2 方法  60-67
    5.2.1 基因组DNA提取  60
    5.2.2 总RNA提取及cDNA第一链的合成  60
    5.2.3 基因组DNA和cDNA克隆  60-63
    5.2.4 植物表达载体的构建及农杆菌转化  63-64
    5.2.5 农杆菌介导拟南芥的转化及阳性植株筛选  64-66
    5.2.6 转基因拟南芥的功能验证  66
    5.2.7 RNA原位杂交  66-67
  5.3 结果与分析  67-75
    5.3.1 白菜BcCUC1基因的克隆及基因结构分析  67-69
    5.3.2 白菜BcCUC1基因的进化分析  69-70
    5.3.3 白菜BcCUC1基因的表达模式  70-71
    5.3.4 白菜BcCUC1基因在拟南芥中功能研究  71-72
    5.3.5 BcCUC1、AtSTM在过表达BcCUC1拟南芥胚发育期的表达  72-73
    5.3.6 过表达BcCUC1拟南芥植株对激素敏感性  73-75
  5.4 讨论  75-78
第六章 白菜BcCUC3基因克隆及其功能的初步研究  78-89
  6.1 材料  79
  6.2 方法  79-80
    6.2.1 基因组DNA和总RNA的提取及反转录  79
    6.2.2 白菜CUC基因的克隆与分析  79
    6.2.3 BcCUC3基因在白菜叶全缘和叶缘裂刻近等基因系中的表达分析  79
    6.2.4 植物表达载体pCAM-BcCUC3的构建  79-80
    6.2.5 农杆菌介导法对拟南芥的转化及抗性苗筛选  80
    6.2.6 转基因拟南芥的鉴定  80
  6.3 结果与分析  80-87
    6.3.1 白菜BcCUC3的gDNA和cDNA的克隆及基因结构分析  80-82
    6.3.2 白菜BcCUC3和其它属种同源基因的一致性比较和进化分析  82-84
    6.3.3 BcCUC3在7B和7H幼嫩叶片中的表达分析  84-85
    6.3.4 植物表达载体pCAM-BcCUC3的构建  85
    6.3.5 转基因拟南芥植株的检测与表型分析  85-87
  6.4 讨论  87-89
第七章 结论  89-90
参考文献  90-101
缩略词  101-102
致谢  102-103
个人简介  103

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 白菜类
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