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拟南芥响应多环芳烃（菲）胁迫基因的差异表达与功能分析

作　者: 崔波
导　师: 王宗华
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 多环芳烃(PAHs) 拟南芥荧光定量PCR 失活突变体过表达载体构建
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

多环芳烃（PAHs）污染是全球面临的一个严重的环境问题。随着社会工业化进程的加快,特别是石化燃料的大量使用,PAHs污染已经达到了非常严重的程度。由于其能引起癌症、组织细胞突变等许多人类健康问题,而引起人们的高度关注。植物能从大气、土壤中吸收PAHs,并最终起到修复环境的作用。然而,植物在分子水平上对PAHs的胁迫响应机制尚缺系统研究。本研究选用拟南芥幼苗为材料,以PAHs（菲）等为研究对象,在研究了PAHs（菲）对拟南芥胁迫响应紧密相关的特异蛋白基础上,应用荧光定量PCR技术分析拟南芥响应PAHs（菲）胁迫基因在RNA转录水平上的差异表达情况,为研究植物对PAHs（菲）胁迫的应答及调控机制、为了解PAHs（菲）的信号传导途径提供一定的科学依据。主要研究结果如下:不同时间PAHs（菲）胁迫下,鉴定的29个差异表达蛋白质编码的基因在转录水平上的表达都呈现出显著的差异。其中23个蛋白质编码基因在胁迫过程中表现出上调趋势,6个蛋白质编码基因在胁迫过程中表现出为下调。信号转导蛋白及甲基化酶类编码的基因的表达差异反映出PAHs（菲）胁迫过程中植物核苷二磷酸激酶（At4g11010）及鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白,At1g18080）参与了细胞内的信号传递,并通过胞嘧啶甲基化或去甲基化来调控相关基因的表达或沉默以积极的响应及防御菲胁迫,胁迫24h时响应达到高峰。活性氧相关蛋白、植物防御蛋白等防卫相关蛋白的编码基因表达量除了在胁迫24h时响应达到峰值外,随着时间的延长,胁迫48h时57%的防卫相关蛋白基因表现出第二个响应高峰。光合作用、糖分解代谢及氨基酸合成等代谢相关蛋白编码基因的表达量在胁迫24h时也表现出显著的峰值,反映出植物虽然在胁迫24h内通过加快光合作用、糖分解代谢及氨基酸的合成来积极响应菲胁迫,但随着胁迫时间的延长,光合作用、糖分解代谢及氨基酸的合成等代谢在RNA水平上开始受到一定程度的抑制。此外,本研究还试图从基因失活与激活两方面研究这些差异表达基因的功能。以T-DNA插入失活突变体为材料,研究了差异表达基因失活状态下,突变体拟南芥在PAHs胁迫下的表型变化。研究发现,9个单基因失活突变体中,只有一个突变体（SALK₀46009）（失活基因号:AT1g48030）在根长这一表型上与野生型有显著性差异,而对于其他的突变体,与野生型相比表型差异则并不显著。同时,本研究还构建了两个拟南芥响应PAHs（菲）胁迫的基因的过表达载体（AT1G18080、AT3G16420）,用农杆菌介导法转化拟南芥,为进一步研究这些基因的功能奠定基础。

全文目录

目录  6-8
摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章文献综述  12-22
  1.PAHs污染是全球性环境问题  12-15
    1.1 PAHs及其来源  12
    1.2 我国PAHs污染状况  12-14
      1.2.1 大气中PAHs污染状况  12
      1.2.2 水体中PAHs污染状况  12-13
      1.2.3 土壤中PAHs污染状况  13-14
      1.2.4 水体沉积物中PAHs污染  14
    1.3 PAHs对生物的危害  14-15
  2.生物修复PAHs污染的研究进展  15-16
  3 拟南芥的研究进展  16-21
    3.1 模式植物拟南芥  16-17
    3.2 拟南芥的分子生物学研究策略  17-19
    3.3 突变技术与拟南芥基因功能的研究  19-21
  4.本研究的目的和意义  21-22
第二章 PAHs(菲)胁迫下拟南芥功能相关基因的转录变化分析  22-37
  1.材料与方法  22-27
    1.1 实验材料  22-23
      1.1.1 拟南芥生态型及相关的突变体  22
      1.1.2 培养基  22
      1.1.3 实验药品  22-23
    1.2 实验方法  23-27
      1.2.1 拟南芥的种植  23
      1.2.2 拟南芥的菲(PAHs)胁迫方法  23
      1.2.3 拟南芥总RNA的提取与质量检测  23-26
        1.2.3.1 Trizol法提取RNA  23-24
        1.2.3.2 RNA的鉴定  24-26
      1.2.4 RNA逆转录生成单链cDNA  26
      1.2.5 Real time PCR方法与结果数据的分析  26-27
  2.结果与分析  27-37
    2.1 RNA质量检测与逆转录为cDNA  27-29
      2.1.1 RNA完整性检测  27-28
      2.1.2 RNA浓度与纯度检测  28
      2.1.3 通过PCR手段检测所提取的RNA是否有DNA污染  28-29
    2.2 在PAHs胁迫下,拟南芥响应胁迫相关基因的转录水平差异分析  29-35
    2.3 小结与讨论  35-37
第三章 T-DNA插入失活突变体的筛选与PAHs(菲)胁迫实验  37-43
  1.材料与方法  37-38
    1.1 实验材料  37
      1.1.1 拟南芥品种  37
      1.1.2 培养基  37
    1.2 实验方法  37-38
      1.2.1 T-DNA插入失活突变体纯合体筛选  37
      1.2.2 PAHs(菲)胁迫拟南芥的方法  37-38
  2.结果与分析  38-41
    2.1 PAHs(菲)胁迫浓度的确定及T-DNA插入失活突变体的相关信息  38
    2.2 T-DNA插入失活突变体的纯合体筛选  38-39
    2.3 T-DNA插入失活突变体的PHAs(菲)胁迫实验结果  39-41
  3.小结与讨论  41-43
第四章响应PAHs胁迫相关基因拟南芥过表达载体的构建与转化  43-57
  1.材料与方法  43-47
    1.1 实验材料  43
    1.2 实验试剂  43
      1.2.1 酶  43
      1.2.2 Maker  43
      1.2.3 其他实验试剂  43
    1.3 实验方法  43-47
      1.3.1 拟南芥的种植  43-44
      1.3.2 拟南芥基因组DNA的提取  44
      1.3.3 琼脂糖电泳目的片段的回收  44-45
      1.3.4 质粒提取方案:  45
      1.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl_2法)  45
      1.3.6 DH5a感受态细胞的转化  45-46
      1.3.7 农杆菌感受态的制备与转化方案:  46
      1.3.8 农杆菌转化拟南芥实验方案:  46-47
  2.结果与分析  47-55
    2.1 基因(At1g18080、At3g16420)过表达载体的构建  47-50
      2.1.1 基因At1g18080、At3g16420的T-A克隆  47-50
        2.1.1.1 基因(At1g18080)的T-A克隆  47-49
        2.1.1.2 基因(At3g16420)的T-A克隆  49-50
    2.2 基因At1g18080、At3g16420过表达载体的构建  50-55
      2.2.1 表达载体pFGC5941质粒图谱  50-51
      2.2.2 基因At1g18080过表达载体构建  51-52
      2.2.3 基因At3g16420过表达载体的构建  52-55
        2.2.3.1 表达载体pFGC5941的改造  52-54
        2.2.3.2 基因At3g16420过表达载体的构建  54-55
    2.3 基因At1g18080、At3g16420与表达载体pFGC5941重组质粒转化农杆菌  55
  3.小结与讨论  55-57
第五章总结与展望  57-59
  1.总结  57-58
  2.展望  58-59
参考文献  59-64
致谢  64-65
附录一  65-71
附录二  71-73
附录三  73

拟南芥响应多环芳烃（菲）胁迫基因的差异表达与功能分析

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