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海带低分子量岩藻聚糖硫酸酯的制备及其抗血栓活性研究

作　者: 董诗竹
导　师: 李八方；赵雪
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产品加工与贮藏
关键词: 低分子量岩藻聚糖硫酸酯抗血栓凝血系统纤溶系统血小板聚集
分类号: TQ463
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

我国每年心血管疾病死亡者占因病死亡总人数的40.7%。其比例远高于人类大敌癌症,居各类死因之首,而血栓形成为其主要因素。因此,开发天然、高效、毒副作用小的抗血栓药物成为当今医药领域研究的重点。岩藻聚糖硫酸酯是是褐藻中特有的一种含有硫酸酯的水溶性杂聚糖,化学组成和结构随海藻的种类、生长季节和提取方法的不同而不同。目前对羊栖菜、泡叶藻、昆布等制备的岩藻聚糖硫酸酯的研究较多,但关于海带中岩藻聚糖硫酸酯的研究大多为大分子的杂多糖,结构不清楚,无法解释作用机理,所以有必要对我国海域内生长的海带中的岩藻聚糖硫酸酯进行结构的深入分析,并联系其抗血栓活性,进行构效关系的研究,本文主要从以下两个方面进行研究:一、以我国黄海海域生长的海带提取的岩藻聚糖硫酸酯粗糖为原料,用Q-Sepharose FF阴离子交换分离纯化得到中分子量岩藻聚糖硫酸酯,自由基氧化降解法结合膜分离法得到12种低分子量的岩藻聚糖硫酸酯,以产物的得率、分子量分布、硫酸根含量、中性糖组成及官能团为指标进行分析,获得4个最佳组分,分别为F1、F2、LMWF4a、LMWF4b。二、利用制备出的中分子量岩藻聚糖硫酸酯和高硫高岩藻糖的低分子量岩藻聚糖硫酸酯,选用直流电刺激诱导大鼠颈动脉形成血栓模型,进行抗血栓活性的研究(测定指标为:全阻塞时间,TFPI、TXB2和6-keto-PGF1α);并用有效抑制血栓效果剂量的岩藻聚糖硫酸酯对正常实验动物的凝血系统(测定指标为:APTT值、PT值、TT值、ATⅢ含量和FIB含量)、纤溶系统(测定指标为:全血浆凝块溶解时间、优球蛋白溶解时间、t-PA、U-PA、PAI)和血小板系统(测定指标为:ADP、AA、凝血酶诱导下的血小板聚集率)进行分析,结合血小板的人体外实验(测定指标为:样品、ADP、AA、凝血酶诱导下的血小板聚集率),探讨中分子量岩藻聚糖硫酸酯和低分子量岩藻聚糖硫酸酯的作用机理。主要结论如下:1.中分子量岩藻聚糖硫酸酯硫酸根连接在糖的C2或C3位处于平伏键位置,主要含有岩藻糖和半乳糖。2.自由基氧化降解粗糖,过氧化氢浓度越高,产物的分子量越低,硫酸根和岩藻糖的含量也会下降,所得的低分子量岩藻聚糖硫酸酯主要含有岩藻糖和半乳糖,有可能在糖的C2和C4之间形成双硫取代。9%H2O2和4.5%H2O2氧化降解所得的低分子量岩藻聚糖硫酸酯在300-2500Da内的组分无显著差别,分子量为1.5kDa,组分集中;9%H2O2氧化降解粗糖得到的低分子量糖的硫酸根含量明显低于4.5%的H2O2,但二者的产物都主要集中在2500-6000Da;硫酸根含量最高的组份是4.5%H2O2氧化降解4.5g粗糖所得的低分子量岩藻聚糖硫酸酯在2500-10000Da内的组分LMWF4b硫酸根含量最高。3.采用加热溶剂和脱气法对传统氯化钡-明胶法进行改进后精密度和稳定性都得到提高,实验试剂和仪器成本低,适合普通实验室和化验室测定海带岩藻聚糖硫酸酯中硫酸根含量的使用。离子色谱法在测定海带岩藻聚糖硫酸酯中硫酸根的含量时比氯化钡-明胶法所需样品少,不受其他离子及杂质的干扰,精密度比改进后的氯化钡-明胶法更高,适合在海带岩藻聚糖硫酸酯的硫酸根含量的检测中推广。4.岩藻聚糖硫酸酯的分子量越大,抗血栓能力越强,并呈剂量依赖关系。5.海带中分子量岩藻聚糖硫酸酯的体内抗血栓活性主要作用于外源凝血途径,并通过抑制血小板花生四烯酸的代谢途径抑制血小板的聚集,对内源凝血途径的延长效果和纤溶系统的激活不明显,人体体外实验对ADP和凝血酶诱导的血小板聚集有促进作用。6.海带低分子量岩藻聚糖硫酸酯的抗血栓活性既可延长外源凝血途径,也可延长内源途径,并且可以激活纤溶系统,同时通过抑制血小板和血管花生四烯酸的代谢抑制血小板的聚集。?

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-16
1 前言  16-31
  1.1 海带研究概况  16-18
    1.1.1 植物学性状研究  16-17
    1.1.2 营养成分研究  17
    1.1.3 生理功能研究  17-18
    1.1.4 海带的开发利用  18
  1.2 海带岩藻聚糖硫酸酯的研究概况  18-26
    1.2.1 不同分子量岩藻聚糖糖硫酸酯的制备、分离与纯化方法  18-20
      1.2.1.1 海带岩藻聚糖糖硫酸酯粗糖的提取及纯化  18
      1.2.1.2 海带不同分子量岩藻聚糖硫酸酯的提纯与分离纯化  18-20
    1.2.2 岩藻聚糖硫酸酯的结构研究  20-22
    1.2.3 海带岩藻聚糖硫酸酯的生物学功能简介  22-26
      1.2.3.1 抗凝血功能  22-23
      1.2.3.2 抗血栓功能  23-24
      1.2.3.3 其它生物学功能简介  24-26
  1.3 血栓性疾病概述  26-29
    1.3.1 血栓疾病的危害及分类  26
    1.3.2 血栓的形成机制  26-27
    1.3.3 血栓疾病的治疗药物的应用现状及前景  27-29
      1.3.3.1 抗凝药物  27
      1.3.3.2 抗血小板药物  27-28
      1.3.3.3 溶栓药物  28-29
  1.4 课题意义  29
  1.5 主要研究内容  29-31
2 不同分子量海带岩藻聚糖硫酸酯的制备、分离纯化及化学组成研究  31-53
  2.1 材料、试剂和仪器  31-33
    2.1.1 材料  31
    2.1.2 主要试剂  31-32
    2.1.3 主要仪器  32-33
  2.2 方法  33-37
    2.2.1 Q-Sepharos FF 阴离子交换制备中分子量岩藻聚糖硫酸酯..  33
    2.2.2 自由基氧化降解法制备低分子量岩藻聚糖硫酸酯  33-34
    2.2.3 分子量的测定－高效凝胶过滤色谱法  34
    2.2.4 硫酸根含量的测定  34-36
      2.2.4.1 传统氯化钡-明胶法  34-35
      2.2.4.2 改进后氯化钡-明胶法  35
      2.2.4.3 离子色谱法  35-36
    2.2.5 中性糖含量的测定-糖醇乙酸酯衍生物气相色谱法  36
    2.2.6 红外光谱分析糖链结构  36-37
  2.3 结果与讨论  37-50
    2.3.1 高效液相色谱分析结果  37-42
    2.3.2 硫酸根含量结果  42-47
      2.3.2.1 传统氯化钡-明胶法  42-43
      2.3.2.2 改进后氯化钡-明胶法  43-44
      2.3.2.3 离子色谱法  44-47
    2.3.3 高硫低分子量组分中性糖含量的分析  47-48
    2.3.4 红外光谱分析结果  48-50
  2.4 小结  50-53
3 岩藻聚糖硫酸酯抗血栓活性的研究  53-63
  3.1 材料、试剂和仪器  54-55
    3.1.1 材料  54
      3.1.1.1 样品  54
      3.1.1.2 实验动物  54
    3.1.2 试剂  54
    3.1.3 主要仪器  54-55
  3.2 实验方法  55-56
    3.2.1 试剂配制  55
    3.2.2 实验步骤  55-56
    3.2.3 统计学分析  56
  3.3 实验结果  56-61
    3.3.1 不同刺激电流对全阻塞时间的影响  56-59
    3.3.2 各组血浆中血液因子的比较  59-61
  3.4 讨论  61-63
4 岩藻聚糖硫酸酯对大鼠凝血系统的影响  63-69
  4.1 材料、试剂和仪器  64
    4.1.1 材料  64
      4.1.1.1 样品  64
      4.1.1.2 实验动物  64
    4.1.2 试剂  64
    4.1.3 仪器  64
  4.2 实验方法  64-65
    4.2.1 试剂配制  64
    4.2.2 实验步骤  64-65
    4.2.3 统计学分析  65
  4.3 实验结果  65-67
  4.4 讨论  67-69
5 低分子量岩藻聚糖硫酸酯对纤溶系统的影响  69-74
  5.1 材料、试剂和仪器  69-70
    5.1.1 材料  69
      5.1.1.1 样品  69
      5.1.1.2 实验动物  69
    5.1.2 试剂  69
    5.1.3 仪器  69-70
  5.2 实验方法  70-71
    5.2.1 试剂配制  70
    5.2.2 实验步骤  70
    5.2.3 统计学分析  70-71
  5.3 实验结果  71-72
  5.4 讨论  72-74
6 抗血小板聚集的大鼠体内实验和人体外实验  74-85
  6.1 材料、试剂和仪器  74-75
    6.1.1 材料  74
      6.1.1.1 样品  74
      6.1.1.2 实验动物  74
    6.1.2 试剂  74
    6.1.3 仪器  74-75
  6.2 实验方法  75-77
    6.2.1 试剂配制  75
    6.2.2 实验步骤  75-76
      6.2.2.1 人体外血小板实验  75
      6.2.2.2 低分子量岩藻聚糖硫酸酯对大鼠血小板聚集的影响  75-76
    6.2.3 统计学分析  76-77
  6.3 实验结果  77-83
    6.3.1 人体外血小板实验  77-80
    6.3.2 ADP、AA、凝血酶对正常大鼠血小板聚集的影响  80-81
    6.3.3 ADP、AA、凝血酶对正常大鼠血小板聚集的影响  81-83
  6.4 讨论  83-85
7. 小结  85-88
8 创新点  88-89
参考文献  89-96
致谢  96-97
个人简历  97
硕士在读期间发表的论文  97

海带低分子量岩藻聚糖硫酸酯的制备及其抗血栓活性研究

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