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辅酶B_(12)合成菌的筛选及相关合成基因的克隆表达和应用

作　者: 翟伟锋
导　师: 方慧英
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 甘油 辅酶B12 1,3-丙二醇 甘油脱水酶 维生素B12
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


在甘油的还原途经中,甘油脱水酶(GDHt)的催化为限速步骤,催化过程需要辅酶B12(腺苷钴胺素,AdoCbl)作为辅酶,且底物甘油可以导致AdoCbl Co-C键的不可逆断裂,致使GDHt的自杀性失活。昂贵的氰钴胺素(CNCbl)的添加是限制发酵产1,3-丙二醇的经济因素之一。为了克服1,3-丙二醇发酵过程中GDHt对外源添加的CNCbl的依赖,本研究着重构建了AdoCbl的合成和转化途径,并取得了一定的成果。本研究从12份样品中分离出67个单菌落,在以乙醇胺为唯一氮源的筛选培养基中培养,筛选得到菌株A24。根据A24菌落形态、显微形态、生理生化特性,结合16S rRNA序列比对分析,鉴定菌株A24为Bacillus. megaterium。以筛选得到的B. megaterium基因组为模板,利用PCR扩增的方法得到了AdoCbl合成途径中编码尿卟啉原Ⅲ甲基转移酶关键基因cobA,同时从Klebsiella pneumoniae中扩增了编码谷氨酰tRNA还原酶基因hemA,并成功构建了含hemA和cobA的串联表达载体pUC18-tac-cobA-tac-hemA。将表达载体pUC18-tac-cobA-tac-hemA转化到Escherichia coli JM109中得到重组菌E. coli JM109(pUC18-tac-cobA-tac-hemA),经IPTG诱导后的发酵液中含有大量卟啉类物质,说明关键基因cobA与hemA正确表达。将表达载体pUC18-tac-cobA-tac-hemA与含有GDHt基因dhaB和1,3-丙二醇氧化还原酶基因yqhD的重组质粒pEtac-dhaB-tac-yqhD共转化到E. coli JM109中得到重组菌E. coli JM109(pUC18-tac-cobA-tac-hemA/pEtac-dhaB-tac-yqhD),摇瓶发酵结果表明菌株E. coli JM109(pEtac-dhaB-tac-yqhD) CNCbl的最适添加量为0.008 g/L,重组菌E. coli JM109(pUC18-tac-cobA-tac-hemA/pEtac-dhaB-tac-yqhD) CNCbl的最适添加量为0.004 g/L,而1,3-丙二醇产量不变,说明关键基因cobA与hemA的表达降低了重组菌对外源添加CNCbl的依赖。为了进一步研究CNCbl转化为具有活性的AdoCbl的过程,从K. pneumoniae中克隆得到了钴胺素腺苷转移酶(ACA)基因btuR和还原酶基因yciK,并构建了含双启动子的表达质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK,将pUC18-tac-btuR-tac-yciK转化E. coli JM109得到重组菌E. coli JM109(pUC18-tac-btuR-tac-yciK)。RT-PCR实验和全细胞蛋白SDS-PAGE电泳分析结果表明btuR和yciK在重组菌中都得到了正确的表达。钴胺素腺苷转移酶活性分析结果表明重组菌E. coli JM109(pUC18-tac-btuR-tac-yciK)的粗蛋白可以将羟基钴胺素(HOCbl)转化为AdoCbl,说明重组表达蛋白具有生物活性。当重组菌E. coli JM109(pUC18-tac-btuR-tac-yciK)和对照菌E. coli JM109(pUC18)同时在以乙醇胺为唯一氮源的培养基中培养24 h后,重组菌的OD600值是对照菌的1.4倍,表明重组菌中btuR和yciK的正确表达,促进了CNCbl转化为具有生物活性的AdoCbl。本研究为1,3-丙二醇发酵过程中GDHt的复活研究提供了新的思路。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章 绪论  8-16
  1.1 生物法合成1,3-丙二醇  8-11
    1.1.1 1,3-丙二醇合成菌  8
    1.1.2 微生物法转化甘油生成1,3-丙二醇  8-10
    1.1.3 甘油脱水酶  10-11
    1.1.4 生物法合成1,3-丙二醇过程中CNCbl 的添加  11
  1.2 维生素B_(12) (钴胺素)的生物合成  11-12
    1.2.1 维生素B_(12) 概述  11-12
    1.2.2 AdoCbl 的生物合成  12
  1.3 典型的依赖维生素B_(12) 的反应  12-13
    1.3.1 乙酰-CoA 的合成  13
    1.3.2 产甲烷古细菌的甲基转移  13
    1.3.3 核苷酸还原酶  13
    1.3.4 肠道细菌中依赖维生素B_(12) 的发酵过程  13
  1.4 AdoCbl 生物合成过程中的关键步骤  13-15
    1.4.1 氨基乙酰丙酸合成酶  13-14
    1.4.2 尿卟啉原Ⅲ甲基转移酶  14
    1.4.3 钴胺素腺苷转移酶(ACA)  14-15
  1.5 立题背景  15
  1.6 研究内容  15-16
第二章 材料与方法  16-22
  2.1 试验材料  16-17
    2.1.1 主要试验仪器  16
    2.1.2 工具酶与试剂  16
    2.1.3 菌株与质粒  16
    2.1.4 培养基  16-17
  2.2 试验方法  17-22
    2.2.1 培养方法  17
    2.2.2 常规分子实验方法  17
    2.2.3 感受态E.coli 的制备  17
    2.2.4 感受态E.coli 的转化  17-18
    2.2.5 原核生物染色体的提取  18
    2.2.6 SDS-PAGE 凝胶电泳  18
    2.2.7 卟啉类物质的定性检测  18
    2.2.8 1,3-丙二醇的检测  18
    2.2.9 腺苷转移酶的分析  18
    2.2.10 AdoCbl 合成菌的筛选  18-19
    2.2.11 16S rRNA 序列的测定  19
    2.2.12 重组菌E. coli JM109(pUC18-tac-cobA-tac-hemA)的构建  19-20
    2.2.13 重组菌E. coli JM109(pUC18-tac-btuR-tac-yciK)的构建  20-21
    2.2.14 重组菌的诱导表达  21
    2.2.15 微生物的生理生化反应  21-22
第三章 结果与讨论  22-37
  3.1 AdoCbl 产生菌的筛选  22-24
    3.1.1 土样的分离培养  22
    3.1.2 AdoCbl 合成能力的初步鉴定  22
    3.1.3 形态学特征  22-23
    3.1.4 A24 的生理生化反应  23-24
    3.1.5 A24 16S rRNA 序列同源性分析  24
  3.2 cobA 和hemA 的克隆表达及对合成1,3-丙二醇的影响  24-30
    3.2.1 cobA 和hemA 基因的扩增  25
    3.2.2 重组质粒pUC18-tac-cobA-tac-hemA 的构建  25-27
    3.2.3 卟啉类物质的定性检测  27-28
    3.2.4 重组质粒pUC18-tac-cobA-tac-hemA 与pEtac-dhaB-tac-yqhD 的共转化.  28
    3.2.5 重组质粒pUC18-tac-cobA-tac-hemA 在大肠杆菌中的表达  28-29
    3.2.6 重组大肠杆菌初步发酵实验  29-30
  3.3 CNCbl 转化为AdoCbl 关键基因的表达与鉴定  30-35
    3.3.1 基因btuR 和yciK 的扩增  30
    3.3.2 重组质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK 的构建  30-32
    3.3.3 重组质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK 的RT-PCR 验证  32-33
    3.3.4 重组质粒pUC18-tac-btuR-tac-yciK 在大肠杆菌中的高效表达  33
    3.3.5 腺苷转移酶分析  33-34
    3.3.6 重组菌的进一步验证  34-35
  3.4 主要结论  35-36
  3.5 课题展望  36-37
致谢  37-38
参考文献  38-45
附录： 硕士期间发表论文  45

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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