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红海束毛藻Ⅱ组内含子的鉴定及其剪接机理的研究

作　者: 邵爱云
导　师: 孟清
学　校: 东华大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: II组内含子成熟酶剪接机理同源性分析
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

Ⅱ组内含子是一类具有自我催化功能的大分子RNA,分布于低等真核生物和植物的细胞器、细菌和古细菌基因组中,细胞核基因组和高等真核生物中至今没有发现Ⅱ组内含子。Ⅱ组内含子的一级结构保守性很低,但是都能形成高度保守的二级结构。其二级结构包括6个结构域,即DI～DVI;DI是最大的结构域,而DV是最保守的结构域,它们共同构成Ⅱ组内含子的催化活性中心。很多Ⅱ组内含子的DIV编码成熟酶,负责Ⅱ组内含子的自我剪接和移动。在体内,Ⅱ组内含子能够在多种蛋白质因子的帮助下正确折叠形成天然构象,催化自我剪接;这些蛋白质因子有的由Ⅱ组内含子编码(成熟酶),有的由宿主基因编码。Ⅱ组内含子除了作为催化RNA(核酶)之外,还是一类逆转座子,能够有效地归巢(homing)进入无内含子的等位基因,也能够以极低频率转座(transposition)进入无内含子的非等位基因。现在一般认为Ⅱ组内含子是细胞核剪接体内含子和非长末端逆转座子的祖先。本论文鉴定了红海束毛藻(Trichodesmium erythraeum)基因组中的Ⅱ组内含子,分析了这些Ⅱ组内含子的分布特征,并运用生物信息学工具(如BLAST、CLUSTAL、Mfold)比较系统地研究了这些内含子的结构特征。同时,在大肠杆菌中研究了Ⅱ组内含子的剪接机理;分别构建含有Ⅱ组内含子和成熟酶编码序列的重组质粒,依次转化大肠杆菌,通过筛选获得含有双质粒的阳性克隆,然后诱导表达,提取总RNA,进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),经琼脂糖凝胶电泳检测,最后测序鉴定。研究表明:红海束毛藻基因组中Ⅱ组内含子的分布具有特殊性;约50%的Ⅱ组内含子插入高度保守的蛋白质编码基因内,几个保守基因中存在多个Ⅱ组内含子,而且存在Ⅱ组内含子和蛋白质内含子共存的现象。绝大部分Ⅱ组内含子之间具有高度的同源性(大于70%),而它们的插入位点序列差异性很大,这说明在红海束毛藻基因组中多次发生Ⅱ组内含子的逆转座现象。实验证明TerⅡ6、TerⅡ7、TerⅡ18和TerⅡ24编码成熟酶不能帮助TerⅡ1、TerⅡ2、TerⅡ3、TerⅡ4、TerⅡ6、TerⅡ7和TerⅡ16剪接;TerⅡ8和TerⅡ10编码成熟酶不能帮助TerⅡ6、TerⅡ7和TerⅡ16剪接;TerⅡ16编码成熟酶也不能帮助TerⅡ1、TerⅡ2、TerⅡ3、TerⅡ4和TerⅡ7剪接,但能帮助TerⅡ6和TerⅡ16剪接。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第1章绪论  11-20
  1.1 概述  11
  1.2 研究进展  11-18
    1.2.1 Ⅱ组内含子的分布  11-12
    1.2.2 Ⅱ组内含子的结构和种类  12-15
    1.2.3 Ⅱ组内含子的剪接  15-16
    1.2.4 Ⅱ组内含子的移动性  16-17
    1.2.5 Ⅱ组内含子的起源和进化  17
    1.2.6 Ⅱ组内含子的应用  17-18
  1.3 本论文选题依据和意义  18-19
  1.4 本论文研究内容  19-20
第2章实验材料和方法  20-29
  2.1 实验材料  20-24
    2.1.1 菌株  20
    2.1.2 载体和重组质粒  20-21
    2.1.3 实验仪器  21
    2.1.4 实验试剂  21-24
  2.2 实验方法  24-29
    2.2.1 序列分析和二级结构预测  24
    2.2.2 细菌的培养  24
    2.2.3 细菌的保存  24
    2.2.4 引物磷酸化  24
    2.2.5 限制性内切酶酶切反应  24-25
    2.2.6 琼脂糖凝胶回收  25
    2.2.7 连接反应  25
    2.2.8 电转化感受态细胞的制备  25
    2.2.9 电转化  25-26
    2.2.10 阳性克隆的筛选  26
    2.2.11 细菌质粒的制备  26
    2.2.12 细菌总RNA的制备  26
    2.2.13 核酸定量  26-27
    2.2.14 逆转录反应(RT)  27
    2.2.15 聚合酶链式反应(RCR)  27
    2.2.16 琼脂糖凝胶电泳  27-29
第3章实验步骤和结果  29-63
  3.1 实验流程  29
  3.2 Ⅱ组内含子的鉴定和序列分析  29-38
    3.2.1 Ⅱ组内含子的鉴定  29-31
    3.2.2 Ⅱ组内含子的成对序列比对  31-32
    3.2.3 Ⅱ组内含子的多重序列比对  32-35
    3.2.4 Ⅱ组内含子插入位点的多重序列比对  35
    3.2.5 Ⅱ组内含子二级结构的预测  35-36
    3.2.6 Ⅱ组内含子编码成熟酶的成对序列比对  36-37
    3.2.7 Ⅱ组内含子编码成熟酶的多重序列比对  37-38
  3.3 重组质粒的构建和鉴定  38-49
    3.3.1 含Ⅱ组内含子编码序列重组质粒的构建和鉴定  38-43
    3.3.2 含成熟酶编码序列重组质粒的构建和鉴定  43-49
  3.4 重组质粒的转化和筛选  49-50
    3.4.1 pAM系列重组质粒的转化和筛选  49-50
    3.4.2 pD系列重组质粒的转化和筛选  50
  3.5 实验体系的重建  50-52
  3.6 成熟酶对Ⅱ组内含子剪接的作用  52-63
    3.6.1 Ⅱ组内含子编码的成熟酶对自身剪接的作用  52-54
    3.6.2 TerⅡ6编码的成熟酶对Ⅱ组内含子的作用  54-55
    3.6.3 TerⅡ7编码的成熟酶对Ⅱ组内含子的作用  55-56
    3.6.4 TerⅡ8编码的成熟酶对Ⅱ组内含子的作用  56-57
    3.6.5 TerⅡ10编码的成熟酶对Ⅱ组内含子的作用  57-59
    3.6.6 TerⅡ16编码的成熟酶对Ⅱ组内含子的作用  59-60
    3.6.7 TerⅡ18编码的成熟酶对Ⅱ组内含子的作用  60-61
    3.6.8 TerⅡ24编码的成熟酶对Ⅱ组内含子的作用  61-63
第4章实验分析和讨论  63-68
  4.1 红海束毛藻基因组中Ⅱ组内含子的分布特征  63-65
    4.1.1 红海束毛藻基因组中富含Ⅱ组内含子  63
    4.1.2 Ⅱ组内含子分布于保守基因中  63-64
    4.1.3 多个Ⅱ组内含子共存于一个保守基因中  64
    4.1.4 Ⅱ组内含子和蛋白质内含子共存于一个保守基因中  64-65
  4.2 红海束毛藻基因组中Ⅱ组内含子的逆转座  65-66
    4.2.1 Ⅱ组内含子的同源性  65
    4.2.2 Ⅱ组内含子插入位点的多样性  65
    4.2.3 Ⅱ组内含子编码成熟酶的同源性  65
    4.2.4 红海束毛藻基因组中Ⅱ组内含子的逆转座  65-66
  4.3 Ⅱ组内含子编码成熟酶的交叉反应  66-68
第5章实验结论  68-70
  5.1 实验结论  68-69
  5.2 实验创新点  69
  5.3 实验展望  69-70
参考文献  70-75
附录  75-77
  附录1  75-76
  附录2  76-77
攻读硕士研究生学位期间的研究成果  77-78
致谢  78

红海束毛藻Ⅱ组内含子的鉴定及其剪接机理的研究

内容摘要

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