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产Serpin双歧杆菌菌株筛选与serpin缺失株的构建

作　者: 崔佳
导　师: 魏华；万翠香
学　校: 南昌大学
专　业: 微生物学
关键词: 双歧杆菌 Serpin Plg 多克隆抗体 斑点杂交 插入失活载体
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


双歧杆菌作为人体肠道内的主要菌群,可通过黏附定植肠上皮细胞,形成生物屏障,产生有机酸和降低环境中氧化还原电位等机制,阻止外源微生物特别是致病菌的侵入,从而发挥调节肠道微生态平衡,抗炎症和促进宿主健康等作用。黏附和免疫是双歧杆菌发挥重要生理作用的基础,然而,有关双歧杆菌黏附肠上皮细胞的作用机制和参与免疫作用的物质基础仍不甚清楚,目前有关黏附和免疫的研究主要集中在双歧杆菌的外膜蛋白上。2006年瑞士雀巢公司研究发现长双歧杆菌的细胞表面存在丝氨酸蛋白酶抑制剂-Serpin (serine protease inhibitor),由350至500个氨基酸组成,起着保护菌体抵抗外源蛋白酶的消化等作用。近四年原核生物的Serpin研究引起了关注,然而双歧杆菌中Serpin的研究报道甚少。本研究通过两种方法来筛选Serpin蛋白。(1)根据plasminogen (Plg)且有Serpin底物结构域一丝氨酸蛋白酶结构域的特点,本研究采用磁珠法偶联μplg蛋白与双歧杆菌共孵育,捕获Serpin或类Serpin蛋白,结果显示μplg蛋白捕获到外膜蛋白中一个60 kD的蛋白；(2)由于serpin基因的同源保守性较差,通过保守序列引物扩增的方法很难达到分离serpin的目的。为此,本研究通过制备Serpin多克隆抗体,利用免疫学斑点杂交方法筛选产Serpin或类Serpin蛋白的双歧杆菌,初步筛选到婴儿双歧杆菌WBAN07中产Serpin蛋白。此外,本研究构建了serpin插入失活载体,试图利用自身同源重组将B.longum WBL001中的serpin基因失活,得到serpin基因的缺失突变株,为后续serpin的功能研究奠定了基础。综上所述,本文为筛选益生菌功能蛋白提供了方法学参考,为研究其黏附机制开辟了新的途径。

全文目录


摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
缩略语索引  6-11
第一章 双歧杆菌丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展  11-17
  前言  11
  1.1 Serpin的研究进展  11-14
    1.1.1 Serpin的结构  11-12
    1.1.2 Serpin的作用机制  12-13
    1.1.3 Serpin的功能  13-14
  1.2 双歧杆菌与Plg相互作用的研究  14-16
    1.2.1 Plg的结构  14-15
    1.2.2 双歧杆菌表面蛋白与Plg的黏附  15-16
  1.3 双歧杆菌中Serpin的研究意义  16-17
第二章 利用Plg筛选双歧杆菌表面蛋白  17-42
  前言  17-18
  2.1 材料和试剂  18-19
    2.1.1 菌株和质粒  18
    2.1.2 实验仪器设备及试剂  18
    2.1.3 培养基配制  18
    2.1.4 试剂配制  18-19
  2.2 实验方法  19-30
    2.2.1 提取pDNR-plg质粒  19
    2.2.2 PCR扩增μPlg基因  19-20
    2.2.3 回收PCR产物  20-21
    2.2.4 连接  21
    2.2.5 转化  21-23
    2.2.6 质粒提取  23
    2.2.7 测序  23
    2.2.8 DNA序列分析  23
    2.2.9 酶切及酶切产物的纯化  23-24
    2.2.10 连接  24
    2.2.11 转化  24-25
    2.2.12 pET22b(+)-μplg阳性克隆子菌落PCR验证  25
    2.2.13 重组质粒pET22b(+)-μplg提取  25
    2.2.14 双酶切表达载体鉴定阳性克隆子  25-26
    2.2.15 融合蛋白的诱导表达及条件优化  26
    2.2.16 SDS-PAGE凝胶的制备  26-27
    2.2.17 SDS-PAGE检测表达蛋白  27-28
    2.2.18 包涵体的收集与溶解  28
    2.2.19 透析复性  28-29
    2.2.20 gPlg蛋白的纯化  29
    2.2.21 gPlg蛋白与磁珠偶联,捕获双歧杆菌黏附蛋白  29-30
  2.3 结果  30-40
    2.3.1 提取pDNR-μplg质粒  30
    2.3.2 PCR扩增μplg  30-31
    2.3.3 PCR产物的回收  31
    2.3.4 菌落PCR验证阳性克隆  31-32
    2.3.5 提取重组质粒  32
    2.3.6 酶切验证阳性克隆  32-33
    2.3.7 测序结果  33
    2.3.8 提取pMD18-T-μplg和pET22b(+)质粒  33-34
    2.3.9 μplg和pET22b(+)双酶切回收结果  34
    2.3.10 菌落PCR验证阳性克隆  34-35
    2.3.11 重组质粒提取结果  35
    2.3.12 酶切验证阳性克隆  35-36
    2.3.13 SDS-PAGE电泳检测目的蛋白表达结果  36-37
    2.3.14 SDS-PAGE电泳检测复性结果  37-39
    2.3.15 SDS-PAGE验证纯化结果  39
    2.3.16 SDS-PAGE验证蛋白黏附结果  39-40
  2.4 讨论  40-42
第三章 Serpin的多抗制备和产Serpin菌株的筛选  42-59
  前言  42
  3.1 实验材料、设备及试剂  42-44
    3.1.1 菌株及质粒  42-44
    3.1.2 实验仪器设备及试剂  44
    3.1.3 试剂配制  44
    3.1.4 培养基配制  44
  3.2 实验方法  44-50
    3.2.1 引物设计与serpin基因的扩增  44-45
    3.2.2 质粒DNA的提取  45
    3.2.3 双酶切及酶切产物纯化  45-46
    3.2.4 连接  46
    3.2.5 转化  46-47
    3.2.6 pBX_2-serpin阳性克隆子菌落PCR验证  47
    3.2.7 重组表达载体pBX2-serpin的提取  47
    3.2.8 双酶切表达载体鉴定阳性克隆子  47
    3.2.9 目标蛋白的诱导表达  47-48
    3.2.10 Serpin蛋白的纯化  48
    3.2.11 免疫小鼠制备抗血清  48
    3.2.12 间接ELISA法检测抗体效价  48-49
    3.2.13 多克隆抗体的特异性纯化  49
    3.2.14 抗体洗脱效率分析  49
    3.2.15 多克隆抗体的特异性检测  49-50
    3.2.16 斑点杂交法筛选双歧杆菌中的类Serpin蛋白  50
  3.3 结果  50-57
    3.3.1 Serpin的扩增结果  50
    3.3.2 pBX_2质粒的提取  50-51
    3.3.3 目的片段serpin和表达载体双酶切产物回收检测  51
    3.3.4 菌落PCR验证阳性克隆子  51-52
    3.3.5 双酶切验证阳性克隆子  52
    3.3.6 抗原表达  52-53
    3.3.7 Serpin蛋白纯化  53-54
    3.3.8 多抗效价检测  54
    3.3.9 抗体纯化结果  54-55
    3.3.10 不同溶液对抗体洗脱效率的影响  55
    3.3.11交叉反应  55-57
    3.3.12 斑点杂交  57
  3.4 讨论  57-59
第四章 插入失活载体的构建  59-68
  前言  59
  4.1 材料和试剂  59-60
    4.1.1 菌株和质粒  59
    4.1.2 实验仪器设备及试剂  59
    4.1.3 试剂配制  59-60
    4.1.4 培养基配制  60
  4.2 实验方法  60-63
    4.2.1 提取pMD18-T-serpin和pNZ44质粒  60
    4.2.2 引物设计与扩增氯霉素抗性基因cmr  60-61
    4.2.3 回收PCR产物  61
    4.2.4 单酶切及酶切产物纯化  61
    4.2.5 开环质粒进行去磷酸化反应与回收  61-62
    4.2.6 连接  62
    4.2.7 将连接产物转化入感受态细胞DH5α  62-63
    4.2.8 pMD18-T/serpin-cmr阳性克隆子菌落PCR验证  63
    4.2.9 单酶切表达载体鉴定阳性克隆  63
    4.2.10 测序  63
  4.3 结果与分析  63-66
    4.3.1 pMD18-T-serpin和pNZ44质粒提取结果  63-64
    4.3.2 cmr的扩增结果  64
    4.3.3 目的片段cmr和载体pMD18-T-serpin酶切产物回收检测  64-65
    4.3.4 载体pMD18-T-serpin去磷酸化后回收检测  65
    4.3.5 菌落PCR验证阳性克隆子  65-66
    4.3.6 酶切验证阳性克隆  66
  4.4 讨论  66-68
第五章 结论与展望  68-70
  5.1 结论  68-69
    5.1.1 Plg对双歧杆菌表面蛋白的黏附研究  68
    5.1.2 Serpin多克隆抗体的制备与筛选产Serpin菌株  68
    5.1.3 Serpin插入失活载体的构建  68-69
  5.2 展望  69-70
参考文献  70-74
附录  74-80
  附录A1 仪器设备  74-75
  附录A2 试剂  75-76
  附录B  76-78
  附录C DNA测序结果  78-80
致谢  80-81
个人介绍  81
攻读学位期间的研究成果  81

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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