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天府肉鹅IFN-α基因克隆表达及抗病毒活性的研究
作 者: 高丽芹
导 师: 刘菲;汪铭书
学 校: 四川农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 天府肉鹅IFN-α 原核表达 复性 生物学活性
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
此文对天府肉鹅IFN-a (TFGoIFN-a)基因(GenBank登录号HQ115583)开展了以下系列研究:TFGoIFN-a基因克隆、TFGoIFN-a原核表达、重组蛋白复性、复性蛋白抗病毒活性的研究。1.TFGoIFN-a基因克隆及生物信息学分析CoA诱导培养天府肉鹅外周血单核细胞,提取RNA,经过RT-PCR扩增得到天府肉鹅IFN-a基因片段,大小为648bp,构建pMD19-TFGoIFN-a克隆载体并测序。TFGoIFN-a基因含有一个576bp的ORF,191个氨基酸组成,分子量大小大约为21kDa,并且信号肽为前28个氨基酸组成,信号肽与成熟肽的切割位点在第28与29个氨基酸之间。TFGoIFN-a是一个多G或C结尾密码子的基因,C3s(密码子第三位为C)的密码子占81.29%,偏爱程度很高。密码子偏爱性特征分析鹅IFN-a基因与鸭IFN-a基因偏爱特征相似,与鸡IFN-a基因有所不同。TFGoIFN-a基因密码子偏爱程度与E.coli,酵母以及人类总密码子偏爱程度的比值比较,差值较大的E. Coli系统有47个,Yeast系统有46个,Human系统有45个。2.TFGoIFN-a表达载体的表达根据信号肽位置设计一对引物,扩增成熟肽TFGoIFN-a片段,构建PMD19-mTFGoIFN-a,并送公司测序,将测序正确的pMD19-mTFGoIFN-a载体与pET-32a(+)双酶切构建表达载体pET-32-mTFGoIFN-α,转化大肠杆菌Rosetta (DE3),采用IPTG诱导表达得到大小为38kDa的重组蛋白,主要以包涵体的形式存在,表达量较大,大约为6mg/mL。3.重组表达蛋白TFGoIFN-a复性及其抗病毒活性的检测TFGoIFN-a重组蛋白通过稀释透析以及Ni-IMAC亲和层析复性后,检测到抗VSV活性为104U/mL,比活性为5.5X103U/mg。并且在GEF和DEF中检测到天府肉鹅IFN-a重组蛋白抗VSV效果是一致的。复性后的鹅IFN-a重组蛋白进行抗GPV, IFN保护组以及GPV组病毒拷贝数之间存在显著性差异(P<0.05),鹅IFN重组蛋白具有抗GPV的活性作用。在GEF中检测得到,对GPV病毒的相对抑制率高达89.4%。
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全文目录
摘要 4-5 ABSTRACT 5-12 第一章 干扰素研究概况 12-21 1 干扰素的分类及特征分析 12-13 2 IFN生物学活性及其机制的研究进展 13-18 2.1 IFN生物学活性的研究进展 13-14 2.2 IFN受体研究概况 14-15 2.3 IFN抗病毒活性机制的研究概况 15-18 2.3.1 PKR研究概况 15-16 2.3.2 OAS和RNase L研究概况 16-17 2.3.3 ADAR和Mx蛋白研究概况 17-18 3 IFN在临床中的应用 18 4 禽类干扰素的研究概况 18-20 5. 选题目的意义 20-21 第二章 天府肉鹅IFN-α基因克隆表达及抗病毒活性的研究 21-57 1 材料 21-25 1.1 菌株及表达载体 21 1.2 毒株及细胞 21 1.3 实验动物 21-22 1.4 主要试剂及配制 22-24 1.4.1 LB液体培养基 22 1.4.2 SDS-PAGE电泳相关液体 22-23 1.4.3 Western-blot相关试剂 23 1.4.4 细胞培养的相关溶液配制 23-24 1.4.5 透析复性相关试剂 24 1.4.6 Ni-IMAC复性相关试剂 24 1.5 主要实验仪器设备 24-25 2 实验方法 25-40 2.1 RT-PCR扩增天府肉鹅IFN-α基因 25-26 2.1.1 引物设计 25 2.1.2 天府肉鹅淋巴细胞培养以及总RNA的提取 25-26 2.1.3 RT-PCR扩增天府肉鹅IFN-α基因 26 2.2 天府肉鹅IFN-α基因的T-载体克隆与鉴定 26-29 2.2.1 天府肉鹅IFN-α基因的T-载体克隆 26-27 2.2.2 感受态细胞的制备及转化 27-28 2.2.3 转化菌落的鉴定和筛选 28-29 2.3 天府肉鹅IFN-α基因的生物信息学分析 29-30 2.3.1 数据 30 2.3.2 分析方法 30 2.4 表达载体的构建 30-34 2.4.1 引物设计 30-31 2.4.2 天府肉鹅干扰素-α成熟肽基因的PCR扩增 31 2.4.3 扩增产物的回收与纯化 31 2.4.4 PCR纯化产物与克隆载体的连接 31-32 2.4.5 连接产物的转化 32 2.4.6 重组原核表达质粒的构建 32 2.4.7 连接产物的转化 32-33 2.4.8 转化菌落的筛选和鉴定 33-34 2.5 重组蛋白的诱导表达及条件优化 34-35 2.5.1 重组质粒pET-32-mTFGoIFN-α转化表达菌 34 2.5.2 原核表达质粒pET-32-mTFGoIFN-α的诱导表达 34 2.5.3 重组质粒表达条件的优化 34-35 2.5.4 蛋白的纯化及鉴定 35 2.6 兔高免血清的制备 35-37 2.6.1 重组蛋白抗原的制备 35 2.6.2 免疫程序 35-36 2.6.3 琼脂扩散试验检测兔抗TFGoIFN-α抗体效价 36 2.6.4 Western-blot检测抗体特异性 36-37 2.7 重组鹅IFN-α蛋白复性 37-38 2.7.1 透析复性 37 2.7.2 Ni-IMAC纯化复性 37-38 2.7.3 蛋白浓度的测定 38 2.8 鹅IFN-α重组蛋白抗VSV活性的研究 38-39 2.8.1 鹅胚成纤维细胞培养 38 2.8.2 鸭胚成纤维细胞培养 38-39 2.8.3 VSV效价TCID50的测定 39 2.8.4 鹅IFN-α重组蛋白抗VSV活性 39 2.9 定量PCR法检测鹅IFN-α重组蛋白抗小鹅瘟病毒活性 39-40 3 结果 40-51 3.1 天府肉鹅IFN-α基因的扩增 40-41 3.1.1 TFGoIFN-α基因的扩增 40-41 3.1.2 TFGoIFN-α基因的T-克隆与鉴定 41 3.2 TFGoIFN-α基因生物信息学分析 41-46 3.2.1 TFGoIFN-α基因分析 41-43 3.2.2 TFGoIFN-α基因密码子特征分析 43-46 3.3 重组表达质粒pET-32-mTFGoIFN-α的构建 46-47 3.4 重组蛋白的表达及条件优化 47-48 3.4.1 重组蛋白的表达 47 3.4.2 IPTG浓度的优化 47-48 3.4.3 诱导时间的优化 48 3.5 兔抗天府肉鹅IFN-α重组表达蛋白多克隆抗体的检测 48-49 3.5.1 兔抗鹅IFN-α血清琼脂扩散试验的检测 48 3.5.2 兔抗血清的Western Blotting检测 48-49 3.6 TFGoIFN-α重组表达蛋白复性 49-50 3.6.1 TFGoIFN-α重组表达蛋白复性效果检测 49-50 3.6.2 TFGoIFN-α重组表达蛋白复性后浓度测定 50 3.7 TFGoIFN-α重组表达蛋白抗VSV活性 50-51 3.8 SYBR Green real-time PCR测鹅IFN-α抗GPV活性 51 4 讨论 51-57 4.1 基因克隆引物和表达引物的设计 51-52 4.2 TFGoIFN-α基因特征分析 52-53 4.3 诱导表达 53-54 4.4 蛋白的复性 54-55 4.5 鹅IFN-α重组蛋白抗病毒活性 55-57 第三章 结论 57-58 第四章 参考文献 58-65 致谢 65-66 作者简介 66 攻读学位期间发表的学术论文 66
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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