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杜氏盐藻S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因SAHHase在鞭毛长度调控中的作用

作　者: 阎赟梦
导　师: 薛乐勋
学　校: 郑州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 杜氏盐藻 SAHHase 鞭毛再生与重吸收
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

杜氏盐藻是一种高度耐盐的单细胞真核藻类,生长条件要求简单,容易培养,具有一对等长的鞭毛,长度大约13μm左右,结构为典型的“9+2”结构,经过简单处理鞭毛可发生再生和重吸收。鞭毛的形态变化在光镜下容易观察,非常适合作为研究鞭毛结构组装的模式生物。鞭毛是一种在多种细胞表面广泛存在的细胞器,参与细胞信号转导、细胞周期调控、细胞运动等,对维持细胞生命活动至关重要。鞭毛结构和调控异常与多种疾病的发生密切相关,如多囊肾、Kartagener综合症等。因此研究鞭毛的调控机制对解决这些疾病的发生有重要意义。鞭毛的组装调控机制目前研究还比较初级,具体的过程尚不明了。现有研究显示鞭毛的组装是一个双向的过程,既正向运输与逆向运输同时进行。IFT颗粒作为运输体,携带鞭毛组装所需"cargo",也称为货物,在动力蛋白kinesin驱动下,沿微管蛋白运送至鞭毛顶端,在顶端卸下货物,组装微管。IFT颗粒在鞭毛顶端转向,携带微管解聚的产物,在动力蛋白dynein的驱动下沿微管返回鞭毛基部。鞭毛的长度调控主要包括再生和重吸收。当鞭毛的正向运输速率大于逆向运输速率时,鞭毛长度增长,即为鞭毛再生。当逆向运输速率大于正向运输速率时,鞭毛趋向于解聚,长度发生缩短,即为鞭毛重吸收。在细胞分裂过程中,鞭毛会发生周期性的再生与重吸收,鞭毛长度的变化可能是细胞周期调控的信号。同时在一些疾病中,也会观察到鞭毛的长度异常。S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHHase)是真核生物甲基化途径中的关键酶,催化甲基转移反应的产物S-腺苷高半胱氨酸水解生成高半胱氨酸与腺苷,抑制其活性可间接抑制甲基转移酶活性,进而抑制甲基化作用。Schneider证实在莱茵衣藻鞭毛重吸收过程中蛋白甲基化通路被激活。虽然Pazour等证实S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHHase)是鞭毛膜基质蛋白组分之一,但目前关于SAHHase在鞭毛长度调控中是否有一定的作用,尚无定论。为研究作为鞭毛组分之一的SAHHase是否参与鞭毛长度调控,本研究选用杜氏盐藻作为模式生物,通过对多个物种SAHHase蛋白保守序列进行比对,设计一对兼并引物,进行RT-PCR,扩增得到327 bp的片段,使用NCBI数据库对测序结果进行Blast分析,结果显示所得片段与莱茵衣藻SAHHase cDNA的同源性为83%,所得片段为杜氏盐藻SAHHase cDNA的一部分。根据所得片段再设计引物,进行RACE PCR,扩增得到SAHHase cDNA的3’末端与5’末端。进行拼接,所克隆的杜氏盐藻SAHHase基因cDNA全长1926bp,包含ORF 1458 bp、3’UTR 61 bp和5’UTR 407 bp。首先研究在转录水平上,SAHHase基因是否与鞭毛的再生与重吸收相关。通过机械研磨法去除杜氏盐藻鞭毛,正常条件下培养,使鞭毛再生,通过秋水仙碱处理使鞭毛重吸收,在再生与重吸收过程中取不同时间点的藻提取RNA,反转录为cDNA,进行实时荧光定量PCR,结果显示,在鞭毛再生与重吸收的过程中,SAHHase mRNA转录量有明显升高。进一步通过Western-blot研究在蛋白水平上SAHHase基因是否与鞭毛的再生与重吸收相关,首先进行原核表达,纯化蛋白,制备抗体。原核表达纯化的蛋白纯度达到90%以上,完全符合制备抗体的要求,将纯化蛋白免疫动物,制备得到效价符合要求的抗体。SAHHase是甲基化途径中的关键酶,本研究证实至少在转录水平上,SAHHase与鞭毛的长度调控相关。而最近也有研究显示在鞭毛的长度调控过程中,部分鞭毛蛋白会发生甲基化与去甲基化的转变,并且有多个甲基化途径中的组分定位于鞭毛上,据此可以推测甲基化可能参与了鞭毛的长度调控,本研究也为这个推测提供了证据。材料与方法1杜氏盐藻藻株、菌种与载体杜氏盐藻藻株为UTEX-LB-1644,购自美国德州大学。使用改良PKS培养基培养,培养条件为：温度26℃,光强4500 Lux,光培养与暗培养各12 h。菌种为E.coli DH5α与E.coli BL21,均为本实验室保存。载体pMD18T-vector购自宝生物公司,pET28 a(+)-vector为本实验室保存。2杜氏盐藻SAHHase基因cDNA全长的克隆比对多个物种中的SAHHase蛋白氨基酸序列,选择其中保守序列,设计简并引物。使用Trizol法提取杜氏盐藻总RNA,反转录得到cDNA。以制备的cDNA为模板,用简并引物进行PCR,扩增得到杜氏盐藻SAHHase基因cDNA片段。再根据扩增得到的片段设计引物,RACE法扩增SAHHase cDNA3’与5’端序列。测序鉴定扩增的片段,根据测序结果使用DNAMAN软件拼接得到SAHHase cDNA全长。3转录水平上杜氏盐藻SAHHase基因与鞭毛长度调控的关系使用机械研磨法处理杜氏盐藻,使其脱去鞭毛,正常培养,使鞭毛发生再生,在再生过程中提取不同时间点杜氏盐藻总RNA；使用秋水仙碱处理法使野生型杜氏盐藻,是鞭毛发生重吸收,在重吸收过程中提取不同时间点杜氏盐藻总RNA。分别将提取的总RNA反转录为cDNA。根据实时荧光定量PCR引物设计要求,设计一对引物,以GAPDH基因作为内参,分别用提取的两个实验组杜氏盐藻cDNA作为模板,进行实时荧光定量PCR,研究转录水平上,杜氏盐藻SAHHase基因与鞭毛长度调控的关系。4杜氏盐藻SAHHase蛋白的原核表达将杜氏盐藻SAHHase基因ORF克隆于原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒,转化E.coli BL21, IPTG诱导目的蛋白表达。5杜氏盐藻SAHHase蛋白的纯化与抗体制备裂解表达SAHHase蛋白的E.coli BL21,使用镍离子柱进行SAHHase蛋白纯化。纯化得到的蛋白通过SDS-PAGE检测纯度,达到制备抗体要求后,免疫动物,制备抗体。结果1杜氏盐藻SAHHase基因cDNA全长的克隆经克隆得到的SAHHase基因cDNA序列全长为1928 bp,其中包括3’UTR306 bp,5’UTR 164bp, ORF 1458 bp,共编码604个氨基酸残基,序列提交Genbank (No. HM180944)。蛋白序列与多个物种的SAHHase具有很高的同源性,其中与莱茵衣藻同源性约为83%。2转录水平上杜氏盐藻SAHHase基因与鞭毛长度调控的关系通过实时荧光定量PCR证实了SAHHase基因至少在转录水平上与鞭毛的再生和重吸收相关,从实验结果可以看出,在鞭毛再生和重吸收过程中SAHHase的转录量均有不同程度的升高。为进一步证实甲基化作用参与了鞭毛的再生和重吸收提供了依据。3杜氏盐藻SAHHase蛋白的原核表达SDS-PAGE结果显示：与对照组相比,诱导组在52 kD左右有特异条带出现,与SAHHase蛋白预期大小相同。SAHHase蛋白得到正确表达。4杜氏盐藻SAHHase蛋白的纯化与抗体制备纯化后蛋白的SDS-PAGE结果显示：纯化的SAHHase蛋白条带单一,无明显杂带,灰度分析显示纯化的纯度达到90%以上,符合制备抗体要求。制备得到的抗体效价达到1：128万。结论1克隆得到杜氏盐藻SAHHase cDNA全长为1928 bp,包括3’UTR 61 bp,5’UTR 407 bp, ORF 1458 bp,共编码486个氨基酸残基。2在转录水平上,杜氏盐藻SAHHase基因参与鞭毛生长调控。3杜氏盐藻SAHHase蛋白分子量为52 kDa。

全文目录

摘要  4-9
Abstract  9-16
1 引言  16-18
2 杜氏盐藻SAHHase基因全长的克隆  18-31
  2.1 材料与方法  18-26
  2.2 结果与分析  26-29
  2.3 讨论  29-30
  2.4 结论  30-31
3 杜氏盐藻SAHHase基因与鞭毛长度调控的关系  31-37
  3.1 材料与方法  31-34
  3.2 结果  34
  3.3 讨论  34-35
  3.4 结论  35-37
4 杜氏盐藻SAHHase蛋白的原核表达  37-46
  4.1 材料与方法  37-41
  4.2 结果  41-44
  4.3 讨论  44
  4.4 结论  44-46
5 杜氏盐藻SAHHase蛋白的纯化与抗体制备  46-55
  5.1 材料与方法  46-50
  5.2 结果  50-53
  5.3 讨论  53-54
  5.4 结论  54-55
参考文献  55-57
综述  57-69
  参考文献  65-69
致谢  69-70
个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果  70

杜氏盐藻S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因SAHHase在鞭毛长度调控中的作用

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