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黑斑蛙Dmrt1和Sox9基因cDNA序列的克隆研究及其精巢组织cDNA文库的构建

作　者: 郑萍萍
导　师: 聂刘旺
学　校: 安徽师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 黑斑蛙 Dmrt1基因 Sox9基因 cDNA文库
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

性别是一个高度保守的性状,但是不同进化地位的物种控制性别发育的分子机制却不尽相同。哺乳类中有雄性性别决定因子Sry基因(Sex-determining region of Y chromosome, Sry),而在非哺乳类的脊椎动物中却缺少Sry基因。因此,研究非哺乳类动物的性别决定和分化相关基因具有重要意义。黑斑蛙是两栖动物,分布广泛,是研究性别发育分子遗传机制的良好模式动物。Dmrt1和Sox9基因分别是Dmrt(Double-sex and Mab-3 related transcription factor)和Sox(SRY related HMG-box gene)基因家族的成员。作为参与发育的基因家族,这两个家族在系统进化上高度保守,在胚胎发育分化、组织器官的形成及相关功能的维持、性别决定和分化等中都具有重要的作用。Dmrt1主要表达于脊椎动物成体的精巢中,在所有脊椎动物中对诱导精巢的正常发育起着至关重要的作用。Sox9基因高度保守,参与性别决定,诱导足细胞的发育,而且还参与骨、神经系统和心血管的发育。为进一步研究Dmrt1基因和Sox9基因,本文采用SMART技术(switching mechanism at 5’end of RNA transcript)获得了黑斑蛙精巢组织双链cDNA。用RACE(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)和RT-PCR(Reverse transcription PCR, RT-PCR)的方法克隆了Dmrt1基因的全长cDNA及Sox9基因的cDNA序列。经过拼接后获得的Dmrt1序列为全长cDNA,由1807个核苷酸组成,其开放阅读框ORF包含1005bp,能编码334个氨基酸;5’UTR(非翻译区)为87bp,3’UTR为712bp。通过BLAST与Genbank上的已知序列进行相似性检索,本文获得的黑斑蛙Dmrt1核苷酸序列与粗皮蛙(Rana rugosa)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)分别具有93%、71%、66%、66%相似性,其推导的氨基酸序列与上述物种具有93%、77%、76%、76%的同源性。通过RT-PCR技术获得黑斑蛙Sox9基因的cDNA序列由1448个核苷酸组成,其开放阅读框ORF含有1446bp,能编码481个氨基酸。通过BLAST与Genbank上的已知序列进行相似性检索比对,发现黑斑蛙Sox9序列与其他物种具有较高的相似性,其核苷酸序列与粗皮蛙,中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)、西方爪蟾(Xenopus tropicalis)、非洲爪蟾、密西西比鳄(Alligator mississippiensis)、人、鼠、鸡(Gallus gallus)分别具有94%、87%、83%、82%、81%、81%、80%、79%的相似性,推导的氨基酸序列与上述物种的一致性分别为96%、93%、91%、90%、85%、80%、81%、84%。ClustalX比对结果也显示这两个基因在动物系统进化上具有较高的保守性。本文研究结果显示,黑斑蛙Dmrt1和Sox9基因在成体黑斑蛙精巢组织中表达。另外,本文还构建了黑斑蛙精巢组织的cDNA文库。经检测原始文库的滴度分别为2.0×106 pfu/mL和2.4×106 pfu/mL,扩增后的文库滴度为0.48×109 pfu/mL和3.0×109 pfu/mL,重组率均在90%以上。其插入片段平均长度约为1.0kb。挑取一阳性克隆分别从5’端和3’端进行测序,得到一长为1170bp的序列。经序列分析知,该序列含有完整的编码框,可编码305个氨基酸,是一全长cDNA序列,提示所建文库是可以用于全长cDNA的筛选。本文所构建的黑斑蛙精巢组织cDNA文库的各项指标均满足建库的基本要求。该文库将为蛙类及两栖类已知的或未知的功能基因及新基因的获得及其研究提供可靠资源;另外,该文库还将为研究蛙类动物的性别决定和分化相关基因及其表达提供直接的分子资料。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章 DMRT1 和SOX9 基因的研究综述  11-22
  1.1 DMRT1 基因的研究综述  11-14
    1.1.1 Dmrt1 基因的发现和结构特点  11-12
    1.1.2 Dmrt1 基因的研究概况  12-14
  1.2 SOX9 基因的研究综述  14-17
    1.2.1 Sox9 基因的发现、命名和结构特点  14
    1.2.2 Sox9 基因研究概况  14-17
  参考文献(REFERENCES)  17-22
第二章黑斑蛙DMRT1 基因CDNA 序列的克隆及分析  22-39
  2.1 材料与方法  23-28
    2.1.1 实验材料  23
    2.1.2 主要试剂  23
    2.1.3 实验器材处理  23
    2.1.4 精巢组织总RNA 的提取  23-24
    2.1.5 cDNA 的合成  24-25
    2.1.6 RT-PCR 和RACE  25-27
    2.1.7 PCR 产物的回收与纯化  27
    2.1.8 克隆及测序  27-28
    2.1.9 序列分析  28
  2.2 结果  28-33
    2.2.1 精巢组织总RNA 的提取  28-29
    2.2.2 cDNA 的合成  29
    2.2.3 RT-PCR 和RACE  29-30
    2.2.4 测序结果  30-33
  2.3 讨论  33-36
    2.3.1 黑斑蛙Dmrt1 基因保守性分析  33-35
    2.3.2 Dmrt1 基因的功能  35
    2.3.3 Dmrt1 的剂量效应  35-36
  参考文献(REFERENCES)  36-39
第三章黑斑蛙SOX9 基因CDNA 序列的克隆及分析  39-52
  3.1 材料与方法  39-41
    3.1.1 实验材料  39
    3.1.2 精巢组织总RNA 的提取  39
    3.1.3 cDNA 的合成  39-40
    3.1.4 RT-PCR  40
    3.1.5 PCR 产物的回收与纯化  40
    3.1.6 克隆及测序  40-41
    3.1.7 序列分析  41
  3.2 结果  41-47
  3.3 讨论  47-48
    3.3.1 黑斑蛙Sox9 基因保守性分析  47
    3.3.2 Sox9 和 Dmrt1 的关系  47-48
  参考文献(REFERENCES)  48-52
第四章黑斑蛙精巢组织CDNA 文库的构建  52-63
  4.1 材料与方法  52-56
  4.2 结果  56-58
    4.2.1 精巢组织总RNA 的提取  56
    4.2.2 cDNA 的合成  56
    4.2.3 cDNA 文库描述  56-58
  4.3 讨论  58-60
    4.3.1 SMART 技术的优点  58-59
    4.3.2 文库构建的质量鉴定  59
    4.3.3 cDNA 文库的功能  59-60
  参考文献(REFERENCES)  60-63
致谢(ACKNOWLEDMENTS)  63-64
附：本人在读研期间发表科研论文及获奖情况一览表  64

黑斑蛙Dmrt1和Sox9基因cDNA序列的克隆研究及其精巢组织cDNA文库的构建

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