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TRAIL_（111-281）蛋白自剪切功能原核表达载体的构建、表达及其生物学活性的初步研究

作　者: 杨文理
导　师: 覃扬；陈守春
学　校: 四川大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体基因合成内含子原核表达纯化生物活性测定
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

【背景与目的】恶性肿瘤患病人数呈逐年上升趋势，危害人类生命健康，正逐渐超过心脑血管疾病而成为人类的头号杀手。近几年肿瘤的凋亡疗法被认为是一种极具潜力的抗肿瘤治疗策略。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducingligand，TRAIL）是TNF超家族新成员，是一种凋亡分子，又叫Apo2L，其基因的染色体定位是3q26，其cDNA全长是1042bp；TRAIL蛋白属Ⅱ型跨膜蛋白，N端位于胞膜内侧，为疏水端，无信号肽序列；C端位于胞膜外侧，为亲水端。全长281个氨基酸残基，其中241个位于胞膜外区，功能部位为114-281位氨基酸残基。其分子量为32.5kDa，等电点为7.63。TRAIL的五种特异性受体：一类是死亡受体TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5），广泛表达于多种正常细胞和肿瘤细胞，TRAIL与DR4或DR5结合可以诱导细胞凋亡；另一类是“诱骗”受体TRAIL-R3（DcR1）和TRAIL-4（DcR2）。DcR1仅表达于正常细胞而不表达于肿瘤组织，DcR2仅表达于胎肝组织和成人睾丸组织，二者皆可竞争性地与TRAIL结合，避免或抑制TRAIL诱导的正常细胞损伤。还有一种受体是osteoprotegerin（OPG），TRAIL与OPG结合可以不诱导细胞凋亡。因此，TRAIL可选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞凋亡，而对正常的组织和细胞不具有明显的毒性效应。TRAIL及其受体的发现为肿瘤的治疗提供了一个新的方向。虽然目前对TRAIL的抗肿瘤的研究已经取得了一些令人兴奋的结果，但是TRAIL诱导细胞凋亡的作用机理还不十分清楚，TRAIL引起肿瘤细胞凋亡的特异性也是争论的焦点，目前认为死亡受体和诱骗受体分布的差异仅仅是其特异性引起肿瘤细胞凋亡的原因之一。此外，TRAIL对人体是否有毒副作用尚无定论，有研究表明在体外TRAIL能引起正常肝细胞的凋亡。本实验是根据以上研究，通过选择大肠杆菌偏爱的密码子，用基因半合成和PCR的方法克隆了TRAIL胞外段基因（编码111—281aa），构建具有自剪切功能的原核表达系统pTWIN1，在大肠杆菌中融合表达出TRAIL蛋白，诱导其在Chitin柱上自剪切，建立了比较简单的纯化方法，获取较高纯度的TRAIL重组蛋白，在体外用人乳腺癌细胞MDA-MB-435测定其生物学活性，为进一步研究TRAIL的作用机理及其临床应用奠定了基础。【方法】根据大肠杆菌密码子偏爱性和自剪切功能的原核表达载体pTWIN1多克隆位点，设计TRAIL胞外段基因（编码111-281aa）引物片段，用基因半合成和PCR的方法获得了TRAIL_111-281基因。将该基因克隆至pMD18-T克隆载体。分别用NruⅠand EcoRⅠ酶切pMD-18T／TRAIL_111-281 and pTWIN1，然后将TRAIL_111-281，目的片段克隆至具有自剪切功能的原核表达载体pTWIN1，再将此重组质粒转化大肠杆菌ER2566，经酶切鉴定及测序鉴定阳性克隆。用IPTG诱导阳性克隆在不同IPTG浓度、不同时间和不同温度下表达融合蛋白，15％SDS-PAGE观察表达产物。再通过用特异性CBD抗体做Western-Blotting进一步鉴定融合表达蛋白。15℃，0.3mmol／L IPTG过夜诱导，破菌后上清经Chitin柱初步纯化，获得TRAIL_111-281目的蛋白。在体外用SRB方法测定其对人乳腺癌细胞MDA-MB-435生物学活性。【结果】用基因半合成和PCR方法成功获得TRAIL胞外段基因（编码111-281aa）长度为550bp。通过酶切、测序等方法鉴定TRAIL_111-281基因正确克隆至原核表达质粒pTWIN1中。15℃，0.3mmol／L IPTG诱导过夜，重组质粒pTWIN1／TRAIL_111-281在大肠杆菌ER2566中成功地表达CBD-Ssp-Intein／TRAIL_111-281融合蛋白，可溶性融合蛋白质量约占菌体总蛋白质量的50％。通过免疫学测定其相对分子质量约为4.5×10⁴Da，与理论值相符。在4℃，pH7.0，该可溶性的融合蛋白在Chitin柱上48-72小时后，约90％发生自剪切，形成约20kDa的TRAIL_111-281蛋白条带，且TRAIL_111-281蛋白未降解。表明TRAIL_111-281融合蛋白可在Chitin柱上进行一次性纯化而得到目的蛋白质条带。SRB方法的初步测定结果表明，TRAIL_111-281蛋白对人乳腺癌细胞MDA-MB-435的IC₅₀为0.005μg／ml，存在一定的量效关系。【结论】成功克隆了可溶性人TRAIL_111-281片段的cDNA，构建了可溶性人TRAIL_111-281基因的自剪切原核表达载体pTWIN1／TRAIL_111-281，并在大肠杆菌中获得高效的融合表达。经免疫印迹证实该蛋白与CBD抗体有特异性结合能力。建立了比较简单的纯化方法，获取了较高纯度的可溶性TRAIL_111-281重组蛋白。TRAIL_111-281蛋白对人乳腺癌细胞MDA-MB-435有明显的抑制作用。

全文目录

缩略词表  4-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
材料  15-20
方法  20-32
结果  32-40
讨论  40-48
结论  48-49
参考文献  49-53
综述  53-69
致谢  69-70

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