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红树林土壤Streptomyces violaceoruber clade的选择性分离
作 者: 谢新强
导 师: 洪葵
学 校: 华南热带农业大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: Streptomyces violaceoruber clade 红树林土壤 生物活性 选择性分离
分类号: S714
类 型: 硕士论文
年 份: 2007年
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内容摘要
用五点采样法从福建九龙江口、广东湛江特呈岛及深圳福田、广西北海以及海南的三亚、儋州、清澜港、东寨港等8个地点的红树林采集了8份红树林土壤样品,利用链霉菌的系统发育特异引物对这8个地点的土壤样品提取的土壤总DNA进行了PCR扩增。对结果阳性的8个土样及它们的混合样,通过湿热、DDC(分散梯度离心)、风干等预处理方法将其在DH、RH、YE、Gause培养基上进行链霉菌及Streptomyces violaceoruber clade的分离。共分离到216株放线菌,对纯培养物进行发酵,发酵液作抗B16肿瘤细胞活性及抗MRSA活性测定,得到抗B16肿瘤细胞活性菌株46株,占总菌株数的21.30%,福建红树林分离到的微生物菌株数不仅多,而且活性菌株比率也较高。得到抗MRSA活性菌株25株,占总菌株数的9.72%,广东深圳红树林分离的MRSA菌活性菌株最多共6株,而且活性菌株比率也最高为27.27%。根据YE培养基上的培养特征对分离到的放线菌初步归类分群,结合测活结果选取28株菌作为代表菌株进行16S rDNA序列分析和细胞壁氨基酸糖份分析(薄板层析TLC),将分离到的放线菌鉴定到属,并构建系统发育树。28株放线菌分布在3个属,分别是:链霉菌属、野野村菌属、马杜拉放线菌属。分析不同预处理方法及分离培养基对分离结果的影响发现:DDC技术处理土样,分离到的菌株主要来自A部分;水浴加热预处理红树林样品时,条件为55℃,20min处理风干红树林土样分离效果好;RH培养基分离的菌株数最多,长出的放线菌多样并少有黄白色链霉菌长出;DH培养基适合于Streptomyces violaceoruber clade的选择性分离。Streptomyces violaceoruber clade宜在酸性环境下分离得到,在pH偏碱的环境中而难于分离到。用核糖核苷类合成酶基因、氨基糖苷类合成酶基因、聚酮合酶基因中的保守序列的特异引物分别对各个代表菌株进行PCR扩增,PCR扩增结果与测活结果比较显示:对某些酶扩增结果阳性的菌株,在抗肿瘤细胞或者抗MRSA未检测到活性。
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全文目录
摘要 3-4 Abstract 4-8 1 前言 8-26 1.1 目的 9-10 1.2 红树林环境 10-11 1.3 生物勘探 11-12 1.4 链霉菌及其Streptomyces violaoeoruber clade 12-15 1.4.1 链霉菌及其次级代谢途径研究 12-13 1.4.2 Streptomyces violaceoruber clade 13-15 1.5 链霉菌的选择性分离 15-19 1.5.1 从环境样品中抽提繁殖体 16-17 1.5.2 环境样品的预处理 17-18 1.5.3 选择性培养基和非选择性培养基 18-19 1.6 链霉菌的分类学 19-25 1.6.1 化学分类 20-23 1.6.2 基因型分类 23-25 1.7 展望 25-26 2 材料与方法(Materials and Methods) 26-38 2.1 Streptomyces violaceoruber clade分离 26-32 2.1.1 培养基 26-27 2.1.2 样品 27-28 2.1.3 链霉菌的生物勘探 28-30 2.1.4 Streptomyces violaceoruber clade的选择性分离 30-32 2.2 活性检测 32-33 2.2.1 抗肿瘤活性检测 32 2.2.2 抗MRSA活性检测 32-33 2.2.3 活性强度标准 33 2.3 代表菌株的16S rDNA序列分析 33-35 2.3.1 放线菌基因组DNA的提取 33 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度及浓度 33-34 2.3.3 16S rDNA的PCR扩增 34 2.3.4 16S rDNA测序 34 2.3.5 序列的校对、整理及分析 34-35 2.4 放线菌细胞壁化学分析(薄板层析TLC) 35-36 2.4.1 代表菌株的细胞壁氨基酸分析 35-36 2.4.2 代表菌株的细胞壁糖份分析 36 2.5 代表菌株的生物活性相关酶基因扩增 36-38 3 结果与分析(Results and Analysis) 38-57 3.1 红树林土壤中的Streptomyces violaceoruber clade分离 38-45 3.1.1 红树林土壤理化性质及养分含量 38-39 3.1.2 链霉菌的生物勘探 39-40 3.1.3 链霉菌的分离结果 40-42 3.1.4 链霉菌的形态分群 42-45 3.2 活性检测 45-47 3.2.1 抗肿瘤细胞活性 45-46 3.2.2 抗MRSA活性检测 46-47 3.3 代表菌株的选择及初步分类鉴定 47-55 3.3.1 代表菌株的选择 47 3.3.2 代表菌株的16S rDNA序列分析 47-52 3.3.3 代表菌株的细胞壁化学分析 52-55 3.4 代表菌株的多种酶基因扩增 55-57 4 讨论 57-62 4.1 不同地区红树林样品对分离结果的影响 57-58 4.2 土样预处理方法对分离结果的影响 58 4.3 培养基对分离结果的影响 58-59 4.4 不同地区红树林分离到放线菌活性比较 59-60 4.5 Streptomyces violaceoruber clade分离情况 60 4.6 细胞壁分析结果与16S rDNA系统发育分析结果比较 60-61 4.7 多种酶基因特异片段扩增结果与微生物活性测定结果比较 61-62 5 结论 62-63 参考文献 63-81 致谢 81
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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 林业基础科学 > 森林土壤学
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