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poly（I：C）对碘过量诱发NOD鼠自身免疫性甲状腺炎的影响

作　者: 刘泽兵
导　师: 臧晓怡；李兰英
学　校: 天津医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: poly(I:C) 碘过量 自身免疫性甲状腺炎 细胞凋亡 炎细胞浸润 甲状腺功能低下 甲状腺 原代培养 NOD鼠
分类号: R581
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


目的膳食中摄入过量碘可能会导致自身免疫性甲状腺疾病的发生，但是其发病机制至今仍未完全阐明。结合研究所发现的病毒感染可参与某些自身免疫性疾病发生，以及在甲状腺细胞系FRTL-5细胞中发现TLR3 mRNA表达并且在Hashimoto’s病人甲状腺标本中100％检测到TLR3蛋白过量表达等实验依据，本文假设，病毒感染对高碘所致自身免疫性甲状腺疾病的发生可能具有一定影响。利用自身免疫性疾病易感的NOD小鼠，通过高碘饮水复制淋巴细胞浸润性甲状腺炎动物模型，以合成的双链RNA poly（I：C）作为病毒类似物，从在体和离体两个方面观察其对高碘引起的甲状腺功能改变、细胞凋亡和淋巴细胞浸润相关因子基因表达变化的作用，探讨poly（I：C）对高碘所致自身免疫性甲状腺炎发病的影响。方法在体实验：选用7-8周龄，雌性NOD鼠，24只随机分为3组，每组8只，分别为：（1）对照组（C：无碘添加水）；（2）高碘组（HI：饮0.05％NaI水）；（3）高碘联合poly（I：C）组（I+P：饮0.05％NaI水并腹腔注射poly（I：C）（按5.0μg／g体重标准，分别于实验第一周和最后一周每日、隔日一次））。作用9周后取材：观测体重、甲状腺重量及解剖形态；采用RIA法检测血清中甲状腺激素及甲状腺特异抗体水平；HE染色观察甲状腺组织形态学变化；TUNEL终端标记法分析甲状腺中细胞凋亡情况；SYBR GREEN实时荧光定量PCR法分析基因NIS、TSH-R、TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM-1的mRNA表达，以GAPDH为内参。离体实验：取7-8周龄NOD小鼠甲状腺，采用I型胶原酶-中性蛋白酶（dispase）双酶法联合消化分离得到甲状腺滤泡上皮细胞。用含10％胎牛血清（FCS）Coon’s F-12培养基接种细胞，24h后细胞贴壁后FCS降至3％，另外添加甲状腺刺激激素（TSH）、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素和L-谷氨酰胺。利用免疫细胞化学染色法、RT-PCR法和电化学发光免疫分析法鉴定培养小鼠甲状腺细胞特性。对成功培养的小鼠甲状腺细胞随机分组并施加处理因素：对照组（C：空白）、高碘组(HI：10-3M KI)、poly（I：C）组（P：25.0μg／m poly I：C）、高碘联合poly（I：C）组(I+P：10-3M KI+25.0μg／ml poly I：C)。处理因素作用24h后，收集细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR法合成cDNA，SYBR GREEN实时荧光定量分析基因NIS、TSH-R、TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM-1的mRNA表达，以GAPDH作为内参基因。结果在体实验：与C组相比，HI组和I+P组两实验组小鼠体重无显著性变化，介于25.0-27.0g之间，而甲状腺绝对重量及相对重量均明显增加（P＜0.01）；血清总T4水平均显著下降（P＜0.05）；各组均未检测到血清抗-Tg Ab、抗-TPO Ab抗体。HE染色结果显示：C组NOD鼠无甲状腺炎症发生；HI组全部发生甲状腺炎，其中甲状腺滤泡受累程度Ⅱ级（12.5％）、Ⅲ级（50.0％）、Ⅳ级（37.5％）；I+P组除全部发生甲状腺炎外，甲状腺滤泡受累程度Ⅳ级所占比例升至50.0％。TUNEL终端标记结果表明，HI组和I+P组凋亡细胞数量较C组明显增加，凋亡指数（AI）升高（P＜0.01）。实时荧光定量RT-PCR结果显示，碘过量可抑制NIS表达，而上调TSH-R、TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM-1的表达；碘过量联合poly（I：C）可进一步加重对NIS表达的抑制，但逆转对TSH-R mRNA表达的上调作用，同时促进TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM-1表达的上调。离体实验：小鼠甲状腺细胞在体外呈贴壁式生长并具有上皮样细胞特点；Tg染色胞浆呈阳性着色；并具有特异TPO、Tg、NIS、TSH-R mRNA表达和分泌T3、T4的功能，但其表达与分泌量有随培养时间的延长呈递减趋势。定量RT-PCR结果与在体结果基本一致：碘过量可抑制NIS表达，而上调TSH-R、TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM-1的表达；碘过量联合poly（I：C）可进一步加重对NIS表达的抑制，但逆转对TSH-R mRNA表达的上调作用；同时促进对TRAIL、TRAIL-sR1、CCL21、CXCL10、ICAM-1表达的上调作用；只是在培养的NOD鼠甲状腺细胞中未检测到CCL21mRNA表达。另外，体外实验单独观察了poly（I：C）对上述基因表达的影响，结果显示poly（I：C）对甲状腺特异基因NIS和TSH-R都具有直接抑制作用，而对其他凋亡相关和免疫细胞浸润相关因子的mRNA表达，除对TRAIL-sR1具有轻微抑制，均呈现不同程度的上调作用。结论1．高碘饮水9周可导致NOD小鼠发生自身免疫性甲状腺炎，表现为血清总T4水平下降，甲状腺中凋亡细胞大量产生，淋巴细胞浸润，局部滤泡破坏，但未检测到甲状腺特异抗体存在。定量PCR结果显示甲状腺中NIS mRNA表达下降，TSH-R、凋亡相关因子TRAIL、TRAIL-sR1以及免疫细胞浸润相关因子CXCL21、CXCL10、ICAM-1mRNA表达上调。2．Poly（I：C）促进高碘作用下血清总T4水平的下降，加重局部滤泡破坏；加剧甲状腺NIS mRNA表达的下降，逆转对TSH-R mRNA表达的上调作用，而协同对凋亡相关因子和免疫细胞浸润相关因子mRNA表达的上调。3．成功建立小鼠甲状腺细胞原代培养模型，并用于观察碘和poly（I：C）单独或联合作用对甲状腺细胞特异基因、凋亡相关因子以及免疫细胞浸润相关因子mRNA表达的影响，除未检测到CXCL21 mRNA表达之外，其他结果与在体结果一致。4．poly（I：C）加重高碘所致自身免疫性甲状腺炎发病程度，其作用的信号途径有待进一步探讨。

全文目录


中文摘要  4-7
ABSTRACT  7-12
英文缩略语(Abbreviation in English)  12-14
前言(Preface)  14-16
第一部分 在体实验(Part Ⅰ)  16-35
  材料与方法(Materials and methods)  16-23
  结果(Results)  23-35
第二部分 离体实验(Part Ⅱ)  35-44
  材料与方法(Materialsandmethods)  35-38
  结果(Results)  38-44
讨论(Discussion)  44-57
小结(Conclusion)  57
参加科研项目  57-58
参考文献(References)  58-66
综述  66-74
致谢(Acknowledgement)  74

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 甲状腺疾病
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