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基于P64K蛋白的胃泌素G17治疗性疫苗的研究

作　者: 熊向华
导　师: 刘志敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 胃肠道肿瘤 胃泌素 脑膜炎球菌 P64K蛋白 治疗性疫苗
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


胃泌素(gastrin，GAS)是胃窦和十二指肠粘膜G细胞分泌的多肽类激素，主要生理作用是促进胃酸分泌和胃肠道粘膜的生长。研究显示胃泌素是胃肠道肿瘤自泌性的生长因子，通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、刺激浸润以及和COX-2协同作用促进肿瘤生长。胃肠道肿瘤的抗胃泌素治疗分为分泌抑制、受体拮抗、反义寡核苷酸抑制和抗胃泌素抗体治疗。本课题的目的是开发一种基于脑膜炎球菌P64K蛋白的针对胃肠道肿瘤的胃泌素G17治疗性疫曲。 我们选用人胃泌素G17N端9个氨基酸的B细胞表位(Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu)作为靶位，这个表位为胃泌素G17和甘氨酸延伸型胃泌素G17所特有，因而产生的抗胃泌素G17抗体不会与G34和CCK发生交叉反应。 P64K蛋白是来自于脑膜炎奈瑟氏球菌的一种外层膜蛋白。P64K蛋白作为载体蛋白可以帮助激活特异性体液免疫反应，近年来研究显示P64K较传统载体蛋白BSA、TT等有更好的免疫增强效果。我们选择P64K蛋白，通过一段多肽交联桥(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)与G17的B细胞表位交联或者是构建G17P64K融合蛋白来作为治疗性疫苗，诱导机体产生抗胃泌素G17的抗体从而中和并清除内分泌或者是源自肿瘤细胞自分泌的胃泌素，达到治疗胃肠道肿瘤的目的。 我们从脑膜炎球菌中通过PCR克隆得到了P64K基因，构建了P64K基因和G17P64K基因的pET28a表达载体，并在大肠杆菌中得到了高表达。目的蛋白经硫酸铵沉淀、疏水层析、分子筛层析和阴离子层析得到纯度超过90％的样品。FMOC同相法化学合成多肽pyro-Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys。MBS法交联多肽与载体蛋白P64K及DT。制备抗胃泌素G17抗体试验分为5组：合成多肽组，P64K蛋白组，DT多肽交联组、P64K多肽交联组和G17P64K融合蛋白组，分别加氟氏佐剂后免疫兔。经两次加强免疫后在DT多肽交联组和P64K多肽交联组动物血清中产生了高滴度的抗胃泌素G17抗体。细胞水平的体外活性评价试验显示抗体有较好的抑制肿瘤生长的生物学活性。

全文目录


中文摘要  7-8
英文摘要  8-10
第一章 前言  10-21
  1.1 人胃泌素概况  10-13
    1.1.1 胃泌素的合成  10-11
    1.1.2 胃泌素的生物活性  11-12
    1.1.3 胃泌素的作用方式  12-13
  1.2 胃泌素与胃肠道肿瘤的关系  13-15
    1.2.1 肿瘤细胞中胃泌素基因的表达  13-14
    1.2.2 胃泌素在恶性肿瘤中的作用机制  14-15
  1.3 胃肠道肿瘤抗胃泌素治疗的研究进展  15-19
    1.3.1 胃泌素分泌抑制  15-16
    1.3.2 胃泌素受体拮抗  16
    1.3.3 反义寡核苷酸抑制  16-17
    1.3.4 抗胃泌素抗体治疗  17-19
  1.4 人胃泌素G17疫苗靶位的选择  19-20
  1.5 P64K蛋白的性质  20-21
第二章 材料与方法  21-27
  2.1 材料  21-24
    2.1.1 菌株  21
    2.1.2 质粒  21
    2.1.3 抗体  21
    2.1.4 细胞及实验动物  21
    2.1.5 限制性内切酶及工具酶  21-22
    2.1.6 DNA和质粒回收试剂盒  22
    2.1.7 核酸及蛋白分子量标准  22
    2.1.8 所有合成的引物  22-23
    2.1.9 主要仪器  23-24
    2.1.10 主要试剂  24
  2.2 方法  24-27
    2.2.1 培养基  24-25
    2.2.2 主要溶液  25-27
第三章 实验步骤  27-42
  3.1 目的基因的克隆  27-30
    3.1.1 脑膜炎球菌P6K基因的克隆  27
    3.1.2 去掉终止密码子的P64K’基因的克隆  27-28
    3.1.3 P64KHis_6基因的克隆  28
    3.1.4 P64KZtag基因的克隆  28-29
    3.1.5 G17P64K融合蛋白基因的克隆  29-30
  3.2 表达载体的构建  30-33
    3.2.1 P64K蛋白表达载体pET28a-P64K的构建  30-31
    3.2.2 去掉终止密码子的P64K蛋白表达载体pET28a-P64K’的构建  31-32
    3.2.3 P64KHis_6蛋白表达载体pET28a-P64KHis_6的构建  32
    3.2.4 P64KZtag蛋白表达载体pET28a-P64KZtag的构建  32-33
    3.2.5 G17P64K融合蛋白表达载体pET28a-G17P64K的构建  33
  3.3 表达载体转化表达菌株及蛋白的表达筛选  33
    3.3.1 表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞  33
    3.3.2 蛋白的表达筛选  33
  3.4 蛋白的纯化  33-36
    3.4.1 蛋白的表达方式和表达水平的确定  33-34
    3.4.2 蛋白样品的硫酸铵沉淀  34
    3.4.3 蛋白样品的Butyl疏水层析  34
    3.4.4 蛋白样品的分子筛层析  34
    3.4.5 蛋白样品的Q柱阴离子层析  34-35
    3.4.6 蛋白样品的Ni柱亲和层析  35
    3.4.7 蛋白样品的S柱阳离子层析  35
    3.4.8 蛋白的N端氨基酸测序  35
    3.4.9 用Lowry法测定样品的蛋白浓度  35-36
  3.5 工程菌5L生物反应器培养  36
  3.6 G17多肽的化学合成  36
  3.7 合成多肽与载体蛋白P64K及DT的交联  36-37
  3.8 兔抗胃泌素G17抗体的制备与纯化  37-40
    3.8.1 兔抗胃泌素G17抗体的制备  37-38
    3.8.2 兔抗胃泌素G17抗体滴度的测定  38-39
    3.8.3 兔抗胃泌素G17抗体的纯化  39-40
  3.9 兔抗胃泌素G17抗体的体外活性评价  40-41
    3.9.1 SW480细胞的培养  40
    3.9.2 兔抗胃泌素G17抗体的体外活性评价  40-41
  3.10 兔抗胃泌素G17抗体的体内活性评价  41-42
第四章 实验结果  42-65
  4.1 目的基因的克隆  42-44
    4.1.1 P6K基因的克隆  42
    4.1.2 去掉终止密码子的P64K’基因的克隆  42-43
    4.1.3 P64KHis_6基因的克隆  43
    4.1.4 P64KZtag基因的克隆  43
    4.1.5 G17P64K融合蛋白基因的克隆  43-44
  4.2 表达载体的构建  44-50
    4.2.1 P64K基因表达载体的构建与酶切鉴定及序列分析  44-48
    4.2.2 去掉终止密码子的P64K’基因表达载体的构建与酶切鉴定及序列分析  48
    4.2.3 P64KHis_6基因表达载体的构建与酶切鉴定及序列分析  48-49
    4.2.4 P64KZtag基因表达载体的构建与酶切鉴定及序列分析  49
    4.2.5 G17P64K基因表达载体的构建与酶切鉴定及序列分析  49-50
  4.3 表达载体转化表达菌株及表达筛选  50-53
    4.3.1 pET28a-P64K表达载体转化表达菌株及表达筛选  50-51
    4.3.2 pET28a-P64KHis6表达载体转化表达菌株及表达筛选  51
    4.3.3 pET28a-P64KZtag表达载体转化表达菌株及表达筛选  51-52
    4.3.4 pET28a-G17P64K表达载体转化表达菌株及表达筛选  52-53
  4.4 蛋白的纯化  53-58
    4.4.1 蛋白表达方式和表达水平的确定  53-55
    4.4.2 蛋白的硫酸铵沉淀  55-56
    4.4.3 P64KHis_6蛋白Ni柱亲和层析  56
    4.4.4 P64KZtag融合蛋白S柱阳离子层析  56-57
    4.4.5 蛋白的纯化  57
    4.4.6 蛋白的N端氨基酸测序  57-58
  4.5 工程菌5L生物反应器培养  58-60
  4.6 G17多肽的化学合成  60-61
  4.7 合成多肽与载体蛋白P64K及DT的化学交联  61
  4.8 兔抗胃泌素G17抗体的制备与纯化  61-62
    4.8.1 兔抗胃泌素G17抗体抗体滴度的测定  61
    4.8.2 兔抗胃泌素G17抗体抗体的纯化  61-62
  4.9 兔抗胃泌素G17血清抗体体外活性评价  62-63
  4.10 兔抗胃泌素G17血清抗体体内活性评价  63-65
第五章 讨论  65-69
结论  69-70
参考文献  70-74
致谢  74-75
发表文章  75-84

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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