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重组IL-4融合蛋白的构建、表达及纯化

作　者: 许艳
导　师: 王丽颖
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 白细胞介素-4 分子伴侣10 凝血因子Xa 重组融合蛋白六聚组氨酸镍亲和层析
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

IL-4是一种在免疫系统中发挥重要作用的具有多种功能的细胞因子，在人类IL-4主要由活化T细胞和肥大细胞产生，成熟人IL-4是分子量为18～19kDa的糖蛋白。IL-4可促使活化的B细胞分裂增殖，并增强B细胞抗原提呈的能力。IL-4是Ig重链基因类转换的主要调节因子，能促使B细胞表达和分泌IgE。IL-4也是CD4+T细胞的自分泌生长因子，促使Th0细胞向Th2细胞分化。此外，IL-4还可以调节造血干细胞的增殖和分化。由IL-4和粒单细胞集落刺激因子（GM-CSF）等多种细胞因子组成的培养体系可在体外诱导树突状细胞（DC）前体细胞——单核细胞，从而获得大量单核细胞来源的DC。DC作为人体内最有效的专职抗原提呈细胞,在人体的抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。因此，IL-4在抗肿瘤免疫治疗方面具有很大潜力，它作为肿瘤免疫调节剂已进入Ⅱ期临床试验。凝血因子Xa是血液凝固所必须的一种糖蛋白。凝血因子Xa首先在氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg中Arg后切割融合蛋白，因此，常被用来切割含有凝血因子Xa蛋白酶切位点的融合蛋白，以获得具有天然氨基酸序列的蛋白质。Chaperonins是分子伴侣中的一个蛋白家族,Cpn10属于其中的一个亚类。Cpn10是存在于绝大多数动物体内的一种极为保守的蛋白质，可以帮助细胞内新合成的蛋白质正确折叠、组装，还可以帮助变性的蛋白质复性及降解无法复性的异常蛋白。分子伴侣是可以介导蛋白质的折叠、分泌及天然构象的形成等加工过程,其本身并不是靶蛋白的组成部分的细胞因子。提高分子伴侣的表达量,可以促进靶蛋白分泌或增加其可溶性。为了解决重组融合蛋白的纯化问题，人们将亲和性标签（6×His tag）构建到重组融合蛋白上，以便用镍亲和层析的方法纯化重组蛋白。镍亲和<WP=64>层析是一种常用的蛋白质纯化方法,它利用金属镍（Ni）与6×His tag之间的亲和性，采用亲和层析的方法就可以将带有6×His tag的蛋白质纯化出来。6×His tag在重组融合蛋白中的位置可以有3种情况：N端、C端和中间。本文的工作主要包括以下几个方面：1 重组FIL-4融合蛋白在大肠杆菌中的表达采用PCR技术扩增后获得含有编码Factor Xa识别位点的FIL-4基因，克隆入pMD18-T载体后测序正确。将FIL-4基因亚克隆入pET28a质粒，构建重组质粒pET28a-FIL-4，然后转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳显示19kDa处出现了一条明显的蛋白质条带。重组FIL-4融合蛋白在大肠杆菌中的表达量较高，但同其它外源真核蛋白一样，重组FIL-4融合蛋白在大肠杆菌中主要以包含体的形式表达。2 含有分子伴侣10基因的两种重组质粒的构建采用PCR技术扩增后获得含有编码6×His tag的HisCpn10基因，克隆入pMD18-T载体后测序正确。将HisCpn10基因亚克隆入pET28a质粒，构建重组质粒pET28a-HisCpn10,经测序证实此重组质粒的基因序列完全正确。同理，将已有的pMD18-T-Cpn10质粒中的Cpn10基因亚克隆入pET28a质粒，构建重组质粒pET28a-Cpn10,经测序证实此重组质粒的基因序列完全正确。在所构建的pET28a-Cpn10和pET28a-HisCpn10两种重组质粒上均含有多克隆酶切位点，可以方便的将目的基因亚克隆入Cpn10基因下游，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达含有该目的基因的重组融合蛋白。3 重组融合蛋白HisCpn10-FIL-4与Cpn10-HisFIL-4在大肠杆菌中的诱导表达采用PCR技术扩增后获得含有编码Factor Xa识别位点及6×His tag的HisFIL-4基因，克隆入pMD18-T载体后测序正确。将所扩增的两种IL-4基因分别亚克隆入所构建的两种重组质粒，成功构建了两种重组质粒——pET28a-HisCpn10-FIL-4与pET28a-Cpn10-HisFIL-4，分别转入大肠杆菌BL21（DE3），在大肠杆菌中表达出在融合蛋白的不同位置带有六聚组氨<WP=65>酸（6×His tag）的两种重组IL-4融合蛋白。SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳显示所表达的两种重组融合蛋白HisCpn10-FIL-4与Cpn10-HisFIL-4分子量均为28kDa。两种重组融合蛋白的表达量相近，较FIL-4无明显差别，且依然主要以包含体形式表达。Western印迹证实两种重组融合蛋白均可与抗组氨酸单克隆抗体特异性结合。4 6×His tag在重组融合蛋白中的位置对镍亲和层析的影响6×His tag在重组融合蛋白中的位置有三种情况：N端、C端和中间。重组融合蛋白HisCpn10-FIL-4在其N端有6×His tag，而重组融合蛋白Cpn10-HisFIL-4在其中间有6×His tag。用镍亲和层析的方法分别纯化两种重组融合蛋白时，重组融合蛋白HisCpn10-FIL-4可以被纯化回来，而重组融合蛋白Cpn10-HisFIL-4却不能被纯化回来。由此看出，用镍亲和层析的方法纯化重组融合蛋白时，6×His tag在重组融合蛋白中的位置对蛋白质的纯化有非常重要的意义，6×His tag可以在融合蛋白的N端和C端，但不能在中间。

全文目录

提要  5-6
英文缩写词表  6-7
前言  7-13
  1 IL-4的研究背景  7-9
    1.1 IL-4的产生、分子结构、基因及其受体  7
    1.2 IL-4的生物学活性  7-8
    1.3 IL-4的应用价值  8-9
  2 分子伴侣的研究现状  9-11
    2.1 分子伴侣的性质  9
    2.2 分子伴侣的分类  9-10
    2.3 分子伴侣的功能  10
    2.4 分子伴侣在基因重组技术中的应用  10-11
  3 固定化金属螯合亲和层析研究进展  11-13
    3.1 固定化金属螯合亲和层析的基本原理  11
    3.2 固定化金属螯合亲和层析在生命科学领域中的应用  11-13
材料与方法  13-24
  1 主要材料  13-14
    1.1 限制性内切酶及其它试剂  13
    1.2 质粒与菌株  13
    1.3 引物合成:由上海生物工程公司合成  13-14
    1.4 层析柱  14
    1.5 培养基  14
  2 主要方法  14-24
    2.1 采用PCR法扩增目的基因  14-16
    2.2 DNA片段的TA克隆  16-18
    2.3 相关质粒的构建  18-19
    2.4 重组IL-4融合蛋白的诱导表达  19
    2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达产物  19-20
    2.6 Western印记鉴定表达产物  20-22
    2.7 用镍亲和层析的方法分别纯化两种重组融合蛋白  22-24
实验结果  24-28
  1 PCR法扩增目的基因及目的片段的TA克隆  24
    1.1 FIL-4与HisFIL-4基因的扩增及TA克隆  24
    1.2 HisCpn10基因的扩增及TA克隆  24
  2 重组质粒pET28a-FIL-4的构建  24-25
  3 重组质粒pET28a-HisCpn10与pET28a-Cpn10的构建  25
    3.1 重组质粒pET28a-HisCpn10的构建  25
    3.2 重组质粒pET28a-Cpn10的构建  25
  4 重组质粒ET28a-HisCpn10-FIL-4pET28a-Cpn10-HisFIL-4的构建  25-26
    4.1 重组质粒pET28a-HisCpn10-FIL-4的构建  25-26
    4.2 重组质粒pET28a-Cpn10-HisFIL-4的构建  26
  5 FIL-4、HisCpn10-FIL-4和Cpn10-HisFIL-4三种重组融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE鉴定  26
  6 Western印记结果  26-27
  7 镍亲和层析纯化结果  27-28
图和照片  28-48
讨论  48-52
  1 重组IL-4融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达  48-50
  2 6×His tag在重组蛋白中的位置对镍亲和层析的影响  50-52
结论  52-53
参考文献  53-61
致谢  61-62
攻读硕士学位期间已(待)发表的文章  62-63
中文摘要  63-66
ABSTRACT  66-69

重组IL-4融合蛋白的构建、表达及纯化

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