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无内源逆转录病毒中国实验用小型猪的筛选鉴定和猪抑肌素基因敲除载体构建

作 者: 陆泉枝
导 师: 连正兴
学 校: 中国农业大学
专 业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 中国实验用小型猪 猪内源逆转录病毒 囊膜蛋白 异种器官移植
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2004年
下 载: 97次
引 用: 1次
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内容摘要


第一部分 无内源逆转录病毒中国实验用小型猪的筛选与鉴定 内源逆转录病毒(endogenous retrovirus,ERV)是一类以前病毒形式整合在生物基因组内的一类逆转录病毒,其本身对宿主没有任何病理作用。ERV大约在约1.2亿年前入侵动物细胞并在动物体内定居,其在哺乳动物的进化中扮演了非常重要的角色。从目前研究来看,几乎所有的哺乳动物包括人类在内都含有这类病毒。 猪内源逆转录病毒(Porcine Endogenous Retrovirus,PERV)是以前病毒形式整合在猪基因组内并垂直传递的一类C型γ病毒,在进化上与长臂猿白血病病毒(GALV)、鼠白血病病毒(MLV)和猫白血病病毒(FeLV)属于同一个分支。从遗传角度推算,猪内源逆转录病毒大约在3千万年前整合到了猪的基因组内。 猪作为异种器官移植的供体有许多优点,但分布在其基因组内的PERV以及猪细胞表面的半乳糖-α-(1,3)-半乳糖(Gal-α-1,3-Gal)残基抗原却是制约猪作为异种器官移植供体的主要因素。研究发现,PERV的拷贝数在不同品种不同个体的猪中存在较大差异,有些品种如我国香猪的基因组内PERV的拷贝数相对较低,而有些品种如南美野猪基因组内甚至不含PERV。 本文通过在实验中选取中国农业大学畜牧实验站的3~6月龄、健康的雌性中国实验用小型猪67头,首先通过PCR进行大规模的筛选检测,对中国实验用小型猪体内的PERV负载情况进行调查,找到了两头不含猪内源逆转录病毒的个体。然后又通过Southern杂交的方法进一步对检测结果予以验证,其结果与PCR检测的结果相符合。 实验中同时还选取含有猪内源病毒的中国实验用小型猪和长白猪各40头,分别对每个猪种基因组内PERV的囊膜蛋白类型进行分析。结果表明从囊膜蛋白类型来看,长白猪和中国实验用小型猪之间没有明显的差异,但在两个猪种中,同时含有两种囊膜蛋白基因(env-A and env-B,记为env-AB)的个体所占比例明显高于仅含一种囊膜蛋白基因(env-A or env-B)的个体比例。 本实验采用PCR和Southern杂交的方法首次在中国实验用小型猪中发现了2头内源病毒负载阴性的个体,其他个体的内源病毒基因拷贝数也相对较低,在10~20个拷贝之间。这充分说明了中国地方猪种的遗传多样性以及中国实验用小型猪作为异种器官移植供体的可行性,同时,也为异种器官移植研究提供了很好的实验材料。

全文目录


缩略语表  6-8
中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一部分 无内源逆转录病毒中国实验用小型猪的筛选鉴定  12-27
  第一章 、 文献综述  12-17
    第一节 、 猪内源逆转录病毒  12-14
    第二节 、 异种器官移植  14-16
    第三节 、 本项目的研究意义  16-17
  第二章 、 无内源逆转录病毒中国实验用小型猪的筛选鉴定  17-27
    第一节 、 材料与方法  17-23
      1.1 实验材料  17-18
      1.2 实验方法  18-23
    第二节 、 结果与分析  23-26
      2.1 PERV聚合酶pol区段的PCR检测  23
      2.2 两种囊膜蛋白类型env-A与env-B的PCR检测  23-24
      2.3 pol区段的克隆与测序  24-25
      2.4 杂交探针的标记效价  25
      2.5 Southern杂交检测  25-26
    第三节 、 总结与讨论  26-27
      3.1 实验总结  26
      3.2 内容讨论  26-27
第二部分 猪抑肌素基因敲除的研究  27-73
  第一章 、 综述部分  27-44
    第一节 、 抑肌素基因MSTN  27-34
      1.1 MSTN基因的发现  27-28
      1.2 MSTN基因的表达作用机理  28-30
      1.3 MSTN基因的同源性进化分析  30-33
      1.4 猪的MSTN基因研究  33-34
    第二节 、 基因敲除  34-42
      2.1 基因打靶  34-36
      2.2 基因敲除的基本流程  36-37
      2.3 基因敲除载体  37-38
      2.4 Cre/LoxP系统  38-40
      2.5 影响基因敲除效率的因素  40-42
    第三节 、 体细胞基因打靶  42-43
      3.1 体细胞基因打靶的特点  42
      3.2 动物体细胞基因敲除的发展现状  42-43
    第四节 、 本项目的研究和意义  43-44
  第二章 、 猪抑肌素基因敲除载体的构建  44-65
    第一节 、 材料与方法  44-59
      1.1 实验材料  44-46
      1.2 实验方法  46-59
    第二节 、 结果与分析  59-63
      2.1 同源臂的扩增克隆鉴定  59-61
      2.2 同源臂的连接与鉴定  61-62
      2.3 同源臂的连接方向性鉴定  62-63
    第三节 、 总结与讨论  63-65
      3.1 实验总结  63
      3.2 内容讨论  63-65
  第三章 、 猪抑肌素基因敲除细胞系建立初探  65-73
    第一节 、 材料和方法  65-68
      1.1 实验材料  65-66
      1.2 实验方法  66-68
    第二节 、 结果与分析  68-71
      2.1 猪胎儿成纤维细胞培养  68-69
      2.2 猪成纤维细胞生长曲线  69
      2.3 猪成纤维细胞电击转染条件的优化  69-70
      2.4 报告基因GFP导入猪成纤维细胞  70
      2.5 采用构建的MSTN敲除载体转染猪成纤维细胞  70-71
    第三节 、 总结与讨论  71-73
      3.1 实验总结  71
      3.2 内容讨论  71-73
参考文献  73-78
附录  78-80
致谢  80-81
作者简历  81

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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