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细菌蛋白HrpA单克隆抗体的制备

作　者: 王天文
导　师: 王宗华；鲁国东
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 丁香假单胞菌 HrpA蛋白 hrp基因单克隆抗体
分类号: S432
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

植物病原细菌中，调控植物过敏性反应和致病性反应的基因称为过敏性反应和致病性基因(hypersensitive reaction and pathogenicity,hrp基因)。几乎在所有的动植物革兰氏阴性病原细菌都含有此类基因。这些基因多组织成基因簇的形式且相当保守。在诱导培养基或植物体内，基因簇中的一个结构基因hrpA编码的蛋白质HrpA，是细菌表面一种丝状且类似鞭毛的表面附属物(Hrp菌毛)的主要组分。Hrp菌毛在植物与病菌的相互作用中扮演十分重要的角色。病原细菌能否使亲和性的植物发病与其Hrp菌毛的有无有直接的和决定性的联系。为进一步研究Hrp菌毛的功能和利用抗体工程方法控制这类植物病害，我们采用杂交瘤技术，对已经转化了丁香假单胞菌番茄变种hrpA基因的大肠杆菌表达的工程蛋白HrpA(Ps)为抗原，经过免疫、融合、筛选、克隆等步骤，获得了可以产生特异性抗体的2株单克隆杂交瘤细胞系。ELISA和Western blotting分析表明，用工程菌株诱导表达的工程蛋白HrpA(Ps)作抗原免疫小鼠获得的杂交瘤细胞其产生的抗体，可以识别丁香假单胞菌番茄变种工程蛋白HrpA(Ps)，但不识别梨火疫病欧文氏菌的工程蛋白HrpA(Ea)，得到的单抗还可以识别丁香假单胞菌番茄变种野生型菌株诱导产生的菌毛中的天然HrpA蛋白，说明所得到的单克隆抗体特异性和亲和性都很好。杂交瘤细胞产生的抗体可以作为相关实验的材料，杂交瘤细胞也可作为从事植物抗体研究时抗体基因的来源。研究结果为认识丁香假单胞菌等第3分泌系统及其致病机制奠定了良好基础。

全文目录

摘要  6-8
1 前言  8-10
2 文献综述  10-27
  2.1 关于过敏性反应与致病性基因(hrp基因)及hrp菌毛  10-18
  2.2 关于抗体工程  18-21
  2.3 关于植物抗体  21-27
3 细菌HrpA蛋白单克隆抗体的制备  27-43
  3.1 材料与方法  27-36
    3.1.1 菌株及实验动物  27
    3.1.2 抗原制备  27-30
    3.1.3 免疫  30
    3.1.4 骨髓瘤细胞培养、冻存与复苏  30-31
    3.1.5 阴性阳性血清的制备  31
    3.1.6 细胞的融合  31-32
    3.1.7 杂交瘤细胞的培养  32
    3.1.8 用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤细胞产生抗体能力  32-33
    3.1.9 通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆  33-34
    3.1.10 Western blotting检测杂交瘤细胞产生的抗体  34-36
  3.2 结果与分析  36-41
    3.2.1 HrpA蛋白诱导和纯化结果  36
    3.2.2 小鼠的免疫效果及其多抗血清  36-37
    3.2.3 脾细胞与骨髓瘤细胞的融合  37
    3.2.4 杂交瘤细胞株产生抗体的特异性和亲和力分析  37-41
      3.2.4.1 杂交瘤培养上清对工程蛋白特异结合的分析结果  37-40
      3.2.4.2 杂交瘤培养上清与天然HrpA蛋白特异结合的分析结果  40-41
  3.3 结论与讨论  41-43
参考文献  43-50
附录: 溶液及试剂  50-54
致谢  54

细菌蛋白HrpA单克隆抗体的制备

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