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多角体/人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合基因在家蚕细胞和幼虫中表达的研究

作　者: 毛励罡
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: hGM-CSF 家蚕杆状病毒表达载体融合表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

粒细胞巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种造血生长因子，它参与造血调节过程。GM-CSF在体内维持着造血细胞的生存、增殖和分化，并且影响着粒细胞，单核-巨噬细胞的生物功能。近年来，在GM-CSF基因工程研究方面得到了迅速发展，如在哺乳动物细胞、酵母、大肠杆菌、昆虫细胞中都得到了成功表达。尽管利用昆虫杆状病毒表达体系能够得到较高表达量的GM-CSF，但其表达水平还是不能与杆状病毒自身的多角体蛋白比较。因此，本次实验中，我们将家蚕杆状病毒多角体蛋白与GM-CSF融合表达，并研究其对GM-CSF表达量的影响。本研究首先通过PCR将家蚕杆状病毒多角体蛋白起始密码子后的18个碱基引入到hGM-CSF基因的5’端之前，然后将融合基因重组与家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，获得重组转移载体pBacPAK8-6aa-hGM-CSF，并与线性化Bm-BacPAK6DNA共转染家蚕细胞株，获得重组病毒BacPAK-6aa-hGM-CSF。PCR和Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有6aa-hGM-CSF基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕细胞(2×10~6个细胞／5ml)，以MOI=5接种家蚕5龄幼虫，结果发现： 1、采用GM-CSF依赖细胞株TF-1和MTT比色法测定表达产物的生物活性，细胞内表达产物、家蚕幼虫和蚕蛹体液都具有较高活性，而阴性对照和空白对照无活性。说明了重组病毒在细胞内、家蚕幼虫和蚕蛹体内得到了成功表达，并且具有活性。 2、通过对表达产物生物活性测定，细胞内表达量为31.98 mg／L，蚕血淋巴表达量为210.9mg／L，蚕蛹内表达量为37.56mg／L。 3、通过对表达产物ELISA检测和MTT比色法检测，发现两者在确定表达量方面存在很大差异，因此推测可能与蚕体内的糖基化有关。4、合前后表达产物的EUSA测定和生物活性测定比较，融合后产物在表达量增加10%情况下，生物活性并升高，推测可能与hGM一CSF的空间结构有关。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-7
缩略语  7-10
第一部分文献综述与实验设计方案  10-30
  第一章粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的研究进展  11-17
    1 GM-CSF的发现  11
    2 GM-CSF的结构与功能  11-13
    3 GM-CSF的作用机理  13-14
    4 GM-CSF的临床应用  14-15
    5 GM-CSF的基因工程研究  15-17
  第二章杆状病毒表达载体系统  17-28
    1 昆虫杆状病毒表达载体系统的基本原理  17-18
    2 转移载体  18-19
    3 重组病毒筛选方案的改进  19-23
    4 影响昆虫系统表达量的因素  23-25
    5 杆状病毒表达载体系统的特点  25-27
    6 杆状病毒表达载体系统的应用展望  27-28
  第三章实验设计方案  28-30
    1 本实验的目的和意义  28
    2 本研究的主要内容  28-29
    3 本研究所要解决的关键问题  29
    4 实验流程图  29-30
第二部分研究内容  30-70
  第四章家蚕杆状病毒重组转移载体的构建  31-44
    1 材料与试剂  31-33
    2 实验方法  33-39
    3 结果与分析  39-41
    4 讨论  41-44
  第五章重组家蚕杆状病毒的筛选和鉴定  44-56
    1 材料与试剂  44-46
    2 实验方法  46-52
    3 结果与讨论  52-56
  第六章目的基因在家蚕、幼虫、蛹中的表达  56-70
    1 材料与试剂  56-59
    2 实验方法  59-63
    3 结果与分析  63-68
    4 讨论  68-70
结论  70-71
英文摘要  71-72
参考文献  72-79
附录  79-80

多角体/人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子融合基因在家蚕细胞和幼虫中表达的研究

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