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2，2\'，4，4\'-四溴联苯醚（BDE-47）诱导孕烷X受体（PXR）致甲状腺毒作用机制的初步探讨

作　者: 胡辛楠
导　师: 雷毅雄；张建清
学　校: 广州医学院
专　业: 卫生毒理学
关键词: BDE-47 PXR受体 TR受体 CYP3A4 UGT1A3 SULT2A1
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

多溴联苯醚化合物(Polybrominated Diphenyl Ethers,PBDEs)是一种新型环境持久性有机污染物,被用作阻燃剂添加到各种潜在可燃材料中。由于其在环境中难降解、滞留时间长、具有亲脂憎水性,并可沿食物链逐级放大,因此生物富集性和持久性是PBDEs的主要环境特征,可对人类和高级生物的健康造成危害。其中2,2’,4,4’-四溴联苯醚(Tetra-brominated diphenyl ethers,BDE-47)是主要蓄积于人体组织和肝脏的单体,其毒性作用主要是内分泌干扰和甲状腺毒性、神经毒性及生殖毒性,但其发挥毒性作用的机制和通路不清。目的:本研究拟通过体外实验,探讨BDE-47是否通过活化PXR受体而诱导Ⅰ相代谢酶细胞色素P450同功酶3A4(CYP3A4)及Ⅱ相代谢酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A3 ( uridine diphospho-glucuronosyl transferas 1A3, UGT1A3)、硫酸转移酶2A1(sulfotransferases 2A1, SULT2A1)的转录表达,并探讨BDE-47对甲状腺激素受体(thyroid hormone nuclear receptors, TRs)两种主要亚型TRα1、TRβ1的转录表达影响,以阐明孕烷X受体(pregnane X receptor ,PXR)在2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE-47)所致甲状腺毒性效应中的作用机制,也为揭示BDE-47一系列其它毒性作用的初步机制提供实验依据。方法:采用CCK-8法测定和分析BDE-47对人肝肿瘤细胞株HepG2的细胞毒性作用。用瞬时共转染含CYP3A4上游启动子序列的萤光素酶报告载体pGL-CYP3A4-Luc、海肾萤光素酶表达载体pGL4.74[hRluc/TK]构建双萤光素酶报告基因系统。用脂质体转染技术及G418筛选、鉴定出稳定高表达hPXR受体的HepG2细胞株HepG2-pCI-hPXR-neo。用BDE-47分别处理双萤光素酶hPXR报告基因系统和稳定高表达hPXR的HepG2细胞株,采用Q-PCR及Western blotting技术观察其对PXR受体下游的代谢酶调控基因CYP3A4、UGT1A3、SULT2A1 mRNA及蛋白转录表达的诱导作用以及对TR受体亚型TRα1、TRβ1转录表达的影响。结果:BDE-47对HepG2细胞有明显的细胞毒性作用,且其毒作用在6~48h呈现明显剂量-时间-效应关系(p<0.01)。48h为毒作用兴奋点,其半数抑制浓度(IC50)为110μmol/L。BDE-47能激活PXR受体,诱导其下游基因CYP3A4表达量的增高,呈明显剂量-时间-效应关系(p<0.01)。BDE-47对PXR受体的下游基因CYP3A4、UGT1A3、SULT2A1的mRNA转录和蛋白表达有显著诱导作用,并呈剂量-效应关系(p<0.01)。进一步分析发现,BDE-47对TRα1、TRβ1的mRNA表达和蛋白表达呈现明显的抑制作用,并呈剂量-效应关系(p<0.01)。结论:PBDEs化合物具有细胞毒性,并且是PXR受体的强激活剂,其可诱导PXR受体下游基因Ⅰ相酶CYP3A4、Ⅱ相酶UGT1A3、SULT2A1 mRNA及蛋白表达水平显著提高,抑制TR受体亚型TRα1、TRβ1 mRNA及蛋白的转录表达。因此,BDE-47可能是通过PXR受体通路发挥其甲状腺毒性效应。

全文目录

中英文对照缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-13
第一部分双萤光素酶报告基因系统及PXR 受体稳定高表达细胞株的构建  13-35
  前言  13
  1.1 材料和方法  13-27
    1.1.1 细胞、质粒和菌株  13-14
    1.1.2 分子生物学试剂盒、主要试剂  14-16
    1.1.3 主要仪器  16-17
    1.1.4 实验方法  17-27
  1.2 结果  27-31
    1.2.1 双萤光素酶报告基因系统的构建及鉴定  27-28
    1.2.2 真核表达载体转染细胞的构建与鉴定  28-31
  1.3 讨论  31-34
    1.3.1 双荧光素酶报告基因系统的构建  31-32
    1.3.2 hPXR 受体高表达细胞株的构建  32-34
  小结  34-35
第二部分 BDE-47 对PXR 受体的诱导作用研究  35-53
  前言  35
  2.1 材料和方法  35-40
    2.1.1 受试系统及细胞培养液  35
    2.1.2 主要仪器  35-36
    2.1.3 分子生物学试剂盒、主要试剂及主要溶液的配方  36-38
    2.1.4 实验方法  38-40
  2.2 结果  40-49
    2.2.1 BDE-47 对HepG2 细胞的毒性作用  40-42
    2.2.2 BDE-47 对HepG2 细胞PXR 受体的诱导作用  42-49
  2.3 讨论  49-52
  小结  52-53
第三部分 BDE-47 对TR 受体的影响作用研究  53-63
  前言  53
  3.1 材料和方法  53-55
    3.1.1 受试系统及细胞培养液  53-54
    3.1.2 主要仪器  54
    3.1.3 分子生物学试剂盒、主要试剂及主要溶液的配方  54
    3.1.4 实验方法  54-55
  3.2 结果  55-60
    3.2.1 BDE-47 对TR 受体表达的影响  55-60
  3.3 讨论  60-62
  小结  62-63
全文总结  63
全文结论  63-64
参考文献  64-70
综述  70-84
  参考文献  79-84
研究生期间发表的论文  84-85
致谢  85-87

2，2\'，4，4\'-四溴联苯醚（BDE-47）诱导孕烷X受体（PXR）致甲状腺毒作用机制的初步探讨

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