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竹节参总皂苷提取、纯化工艺及其抗肿瘤活性的初步研究
作 者: 欧阳丽娜
导 师: 向大雄
学 校: 中南大学
专 业: 药剂学
关键词: 竹节参 总皂苷 提取 纯化 抗肿瘤活性
分类号: R285
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
竹节参(Rhizoma Panacis Japonici)为五加科(Araliaceae)植物竹节参(Panax japonicus C.A.Mey.)的干燥根茎,属土家族珍稀药物资源。竹节参含多种三萜皂苷、多糖、丰富的氨基酸及微量元素等活性物质,兼具北药人参滋补强壮和南药三七活血化瘀之功效,是一种药食两用的天然植物,在临床治疗及保健功能上均具有广泛的应用价值。目前对竹节参的研究主要集中在治疗类风湿性关节炎药物的开发上,竹节参总皂苷(Total saponins of Rhizoma Panacis Japonici,TsPJ)微波提取、大孔吸附树脂纯化工艺研究尚未见文献报道,而其体外抗肿瘤活性方面罕有文献报道。为了充分利用竹节参资源,开发以TsPJ为主要成分的新的药物和新的中成药制剂,本课题建立了TsPJ的含量测定方法,提出了适宜于TsPJ提取和纯化的最佳工艺条件,并对其体外抗肿瘤活性作了初步的探索。主要研究内容和结果如下:LTsPJ的含量测定选用人参皂苷Re为标准品,采用分光光度法,以5%冰乙酸-香草醛溶液和高氯酸为显色剂,在552nm处测定吸光度。以人参皂苷Re的量(μg)为横坐标,以吸光度(A)为纵坐标,制作标准曲线,经计算得回归方程为Y=0.0046X-0.0013(R2=0.9997),在40.48-202.40μg范围内线性关系良好,以此计算TsPJ的含量。经方法学实验结果显示,在90min内吸收值稳定,RSD为1.42%,精密度和重现性良好,RSD分别0.75%和1.51%;平均回收率为100.46%(n=5),RSD为1.06%。此法简便灵敏,重现性良好,方法可靠,可作为竹节参总皂苷的定量方法。2.TsPJ提取工艺的优选以TsPJ转移率为考察指标,在单因素实验的基础上,运用正交实验设计,筛选最佳微波提取工艺;并将其与加热回流提取法及超声提取法进行比较。结果表明,以80%乙醇为提取溶剂,微波功率400W,料液比1:18,提取4次,每次提取5 min,TsPJ的转移率可高达97.77%。微波提取工艺具有效率高、时间短、能耗低、环保等优点,为TsPJ的工业化生产和新药开发提供了依据。3.TsPJ纯化工艺的优选采用静态吸附和动态吸附考察相结合的方法,筛选了5种不同性质的大孔树脂,最终初步确立了D-101型大孔树脂分离TsPJ的纯化工艺:上样浓度为0.2 g生药·mL-1,PH值为6,径高比为1:10,以3BV 70%乙醇溶液洗脱,吸附及洗脱流速均为1mL·min-1。研究结果表明,未纯化前总固物中总皂苷的含量为24.36%,纯化后总固物中的TsPJ含量为82.53%,精制度达338.81%,且转移率可达88.02%。从精制度、转移率等方面考虑,该工艺适宜于TsPJ的分离及纯化。4. TsPJ对肝癌HepG2细胞凋亡作用的考察采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法检测不同浓度的TsPJ对肝癌HepG2细胞增殖的作用;流式细胞仪分析肿瘤细胞凋亡率。结果表明,TsPJ可抑制肝癌HepG2细胞生长,且呈浓度、时间依赖关系。用50、100、200和400μg·mL-1 TsPJ处理细胞48h后,发现TsPJ可诱导细胞凋亡,凋亡率与对照组比较明显升高(P<0.01)。TsPJ抑制肝癌HepG2细胞生长,其机制可能是通过诱导凋亡来发挥作用的。
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全文目录
中文摘要 4-6 英文摘要 6-13 前言 13-16 第一章 竹节参总皂苷含量测定方法的研究 16-21 1 仪器与试药 16 1.1 仪器 16 1.2 试剂与药品 16 2 方法 16-18 2.1 对照品溶液的配制 16-17 2.2 样品溶液的制备 17 2.3 检测波长的确定 17 2.4 标准曲线的制定 17 2.5 样品含量测定 17 2.6 方法学的考察 17-18 3 结果 18-20 3.1 检测波长的确定 18 3.2 标准曲线和回归方程的建立 18 3.3 方法学考察实验 18-20 3.4 TsPJ含量测定方法的确定 20 4 讨论 20-21 第二章 竹节参总皂苷提取工艺的研究 21-30 1 仪器与试药 21 1.1 仪器 21 1.2 试剂与药品 21 2 方法 21-24 2.1 原药材处理 21-22 2.2 对照品和样品液的制备 22 2.3 样品含量测定 22 2.4 微波提取工艺条件单因素考察 22-23 2.5 交实验优选TsPJ微波提取工艺参数 23 2.6 不同提取工艺的比较 23-24 3 结果 24-29 3.1 标准曲线的制备 24 3.2 微波提取条件对TsPJ转移率的影响 24-27 3.3 正交实验优选TsPJ微波提取工艺参数 27-29 3.4 加热回流提取、超声提取、微波提取工艺的比较 29 4 讨论 29-30 第三章 竹节参总皂苷纯化工艺的研究 30-46 1 仪器与试剂 30-31 1.1 仪器 30 1.2 试剂与药品 30-31 2 方法 31-34 2.1 对照品和样品液的制备 31 2.2 样品含量测定 31 2.3 大孔吸附树脂的预处理 31 2.4 树脂的筛选 31-32 2.5 大孔吸附树脂对TsPJ的动态吸附性能研究 32-33 2.6 正交实验优选大孔吸附树脂纯化工艺参数 33-34 2.7 工艺重复验证实验 34 2.8 树脂重复使用周期的考察 34 3 结果 34-44 3.1 标准曲线的制备 34 3.2 不同大孔吸附树脂对TsPJ静态吸附.解析性能的比较 34-35 3.3 D101大孔吸附树脂对TsPJ的动态吸附.洗脱性能研究 35-41 3.4 正交实验优选D101大孔吸附树脂纯化TsPJ的工艺参数 41-42 3.5 工艺重复性验证实验 42-43 3.6 树脂重复使用周期考察 43 3.7 树脂的再生 43-44 4 讨论 44-46 第四章 竹节参总皂苷对肝癌HepG2细胞凋亡作用的考察 46-57 1 仪器与材料 46-47 1.1 仪器 46 1.2 实验材料 46-47 1.2.1 肿瘤细胞系 46-47 1.2.2 主要试剂及配置 47 2 实验方法 47-50 2.1 HepG2细胞培养及传代 47-48 2.2 细胞的冻存和复苏 48 2.3 细胞生长曲线的绘制 48 2.4 细胞形态学考察 48-49 2.5 细胞增殖抑制的测定(MTT法) 49 2.6 流式细胞术检测凋亡 49 2.7 统计学方法 49-50 3 结果 50-55 3.1 HepG2细胞的生长曲线 50 3.2 细胞形态学观察 50-52 3.3 TsPJ对HepG2细胞增殖的影响 52-53 3.4 TsPJ对HepG2细胞凋亡的影响 53-55 4 讨论 55-57 结论 57-59 展望 59-60 参考文献 60-63 综述 63-76 致谢 76-77 攻读硕士期间主要的研究成果 77
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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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