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兔眼IPE和RPE细胞膜的K-NPPase酶组织化学的电镜图像分析

作 者: 王海瑛
导 师: 刘哲丽
学 校: 中国医科大学
专 业: 眼科学
关键词: 虹膜色素上皮 视网膜色素上皮 钾依赖性对硝基苯磷酸酶 钠钾ATP酶
分类号: R77
类 型: 硕士论文
年 份: 2003年
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内容摘要


前言 虹膜色素上皮(IPE)细胞与视网膜色素上皮(RPE)细胞具有相同的胚胎发育来源,基本具备RPE细胞的生理功能,且取材方便,可望代替RPE细胞实现自体移植,治疗老年性黄斑变性(ARMD)等疾病。近年来,国内外学者围绕构建光感受器复合体所需要的RPE细胞的四项生理功能进行大量研究,在IPE细胞和RPE细胞之间进行了大量的比较研究,研究表明在摄取、储存和代谢维生素A、吞噬视杆细胞外节盘膜(ROS)、分泌细胞外间质的多种细胞因子这三个方面,IPE细胞与RPE细胞有许多相似之处,可以代替RPE。但是在物质转运功能方面对RPE和IPE细胞比较研究较少。正常物质转运功能是细胞行使其它生理功能的前提与基础,在IPE细胞和RPE细胞之间进行物质转运功能的比较对IPE能否代替RPE移植具有重要意义。 在物质转运功能中,Na~+,K~+-ATPase是细胞进行物质转运的原动力,在不同的组织,其表达和分布有很大差异。RPE细胞的Na~+,K~+-ATPase分布于RPE顶端与视杆细胞外节盘膜(ROS)衔接处的微绒毛膜上密度最高,与电解质,氨基酸,葡萄糖,水等物质在视网膜和脉络膜之间的转运密切相关;IPE细胞的Na~+,K~+-ATPase分布尚未见报道。本实验中钾依赖性对硝基苯磷酸酶(K-NPPase)是 Na”,K”-ATPase中钾离于依赖性脱磷酸反应的部分,它的活性与Na“,K\ATPase活性密切相关。 目 的 本研究采用KNPPase酶组织化学技术,对兔眼IPE细胞和 RPE细胞的 Na”,K“eTPase进行足位,利用 Metamorph图像分析系统对电镜图像中K-NPPase组化颗粒进行定量分析比较,比较IPE细胞与RPE细胞膜L Na”,K”eTPase的分布情况,为IPE细胞在物质转运方面能否代替RPE细胞行使功能提供理论依据。 材料与方法 1.实验动物:选择健康有色素家兔与无色素(白色)家兔各6只,共门只(由中国医科大学实验动物部提供人 体重2.5上对Kg,平均兔龄6个月,雌雄不限。分组设计为有色素组12只眼和无色素组12只眼;有色素组和无色素组又分别分为IPE组和 RPE组各 12例,在组与组之间进行交叉比较,最后进行总的 IPE组和 RPE组的比较。 2.标本制作:耳缘静脉注射5刀ml空气处死后,无菌操作下摘取家兔双眼球。用 4%多聚甲醛和 0.5%戊二醛混合液(含6%蔗糖)球内灌注及浸泡固定,4 OC,45分钟,将组织切成Zmm X 4mm的薄块。 3.K-NPPaSS酶组化孵 育液面制: 耿 于1**工甘氨酸一**HfR冲液…*二9对川’加入主旋 ·2·咪华6刀Zing及对硝基苯磷酸加g盐p4mg,充分混匀溶解,慢慢滴入 DMSO 2.sml。 b.将构檬酸铅溶于50mmol/L 的KOH溶液中配成4刀mmol/L浓度的溶液,摇匀使之溶解。 c.将b步骤所配制的构檬酸铅一KOH溶液缓慢滴入a步骤所配制的溶液中,最终孵有液呈半透明微绿色。 4.K-NPPase酶组化孵育:将组织薄块浸入孵胄液,青于37OC温箱中,孵育40~50min。 5.电镜观察:将孵育后的组织薄块用 100mmol几 iL十肿酸缓冲液洗涤 smin;置于 1%俄酸司 二甲肿酸缓冲液中固定 30min;用 100M 二甲月酸缓冲 浪冲 洗两次,各5分钟;依次用50o刁0o七0oq0o45o刁o浓度酒精梯度脱水,各30min,再用100o丙酮浸两次,各30min;环氧树脂(Epon812浸透、包埋、聚合;切半薄切片后在光镜下定位,修块:超薄切片 700A,醋酸双氧铀电于染色 10分钟,烘干;电镜观察,主 照。 6.结果分析:采用 Metamorph/DP旧 系统分析电镜照片。随机选取IPE细胞膜上K-NPPase的阳性颗粒以及RPE细胞顶端和 ROS相接的微绒毛上的阳性颗粒相邻两点间的距离进行测量。计算每例样本的均值士标准差(无土S)①5%可信区间),通过t检验进行统计学分析,分别对有色素组和无色素组的IPE组与RPE组数据进行比较,最后再对总的IPE组和 RPE组数据进村比较。 ·3· 结 果 电镜观察:IPE细胞膜与RPE细胞顶端微绒毛膜上均可见K.NPPase颗粒沉积。 有色素组PE组与RPE组KNPPase沉积颗粒间距离经统计学比较无显著性差异,O.5>P列二;无色素组1*E组与RP E组KNPPase沉积颗粒间距离经统计学比较有显著性差异,*刀刀01:有色素组与无色素组汇总后的1*E组和RP E组广*田防e沉积颗粒间距离经统计学比较无显著性差异,0.5>P>0.2。 结 论 兔眼IPE细胞膜表面与RPE细胞顶端微绒毛膜表面均有Na”,K”-ATPase分布,有色素组与无色素组汇总后的IPE组和RPE组KNPPase沉积颗粒间距离经统计学比较无显著性差异,0.5>P>0.2,表明用K-NPPSSe酶组化电镜观察到的IPE细胞与RPE细胞具有相似的物质转运功能。

全文目录


一、 中文摘要  3-7
二、 英文摘要  7-10
三、 英文缩略语  10-11
四、 论文主体  11-22
  1 前言  11-13
  2 实验材料与方法  13-15
  3 实验结果  15-17
  4 讨论  17-21
  5 结论  21-22
五、 本研究新见解  22-23
六、 参考文献  23-25
七、 致谢  25-26
八、 综述  26-35
九、 个人简介  35

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学
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