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中国野桑蚕线粒体基因组研究
作 者: 夏玉玲
导 师: 鲁成
学 校: 西南农业大学
专 业: 特种经济动物饲养
关键词: 中国野桑蚕 线粒体DNA(mtDNA) 全序列 基因 系统分析
分类号: S885
类 型: 硕士论文
年 份: 2003年
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内容摘要
线粒体基因组作为细胞核外的一种遗传系统,具有完整性、多态性、自主性和小型性等独特的优点。对线粒体基因组的研究主要体现在对基因的结构和功能、基因表达的时空调控、核质互作、分子进化规律、物种的起源进化以及线粒体的起源等生物学领域的研究。但是对野桑蚕线粒体基因组的研究目前还处于初级阶段,对中国野桑蚕线粒体方面研究的报道更少。 许多研究证明,“家蚕起源于中国野桑蚕”。目前已经公布了四个家蚕品种和一个日本野桑蚕的线粒体基因组全序列,但中国野桑蚕线粒体基因组的全序列还未见报道,它们之间的系统分析也少有文献。开展中国野桑蚕线粒体基因组的研究,一方面可以丰富线粒体基因组数据库,另一方面通过线粒体基因组比较分析,可以阐明其基因组成、基因排列和基因结构特点及其进化特点,通过系统分析,可以进一步探讨中国野桑蚕与家蚕不同品种、日本野桑蚕的系统演化关系和基因标记的特征。 本论文主要测定和分析了中国野桑蚕线粒体基因组全序列,并且对物种间、品种间mtDNA的进化特点和系统演化等进行了研究。 1.中国野桑蚕线粒体DNA提取方法的建立:由于野外环境的进一步恶化,野生材料越来越少。介于此,为解决材料的时空影响限制。本研究探讨了不同的保存方法和不同细胞破碎方法中国野桑蚕线粒体DNA提取影响,从而建立了一套优化方法。这种方法是先将材料置于-80℃下长期冻存,提取时取出来解冻,研磨与匀浆相结合来破碎细胞,再用常规方法提取线粒体DNA。用这种方法获得的mtDNA既解决了时空限制,又能用于扩增、酶切、克隆和测序。 2.引物的筛选与分析:37个昆虫通用引物中有81%能用于扩增和测序,设计其他区域的引物12个并将其扩增,最终可以完成全序列测定。 3.中国野桑蚕线粒体基因组的分析结果: (1)全序列及其结构分析:通过扩增、克隆、测序和拼接,获得了中国野桑蚕线粒体全基因组序列,全长为15688bp,由13个蛋白质编码基因,2个rRNA基因、24个tRNA基因和AT富集区构成。较4个家蚕品种和1个日本野桑蚕线粒体基因组多2个tRNA,其他组成和排列与这5个序列相同。与其它物种组成和排列都有不同。 (2)酶切图谱:用15种限制酶酶切获得52个位点,其中有24个Taql和互个Pstl酶切位点.与日本野桑蚕和“夏芳”比较,有较大的数目多态性和长度多态性。 (3)突变的比较:与日本野桑蚕比较,有23个编码基因序列发生了突变,共349个突变位点,其中非编码区占277个。与“夏芳”比较,有25个编码基因序列发生了突变,共285个突变位点,其中非编码区136个突变。与日本野桑蚕和“夏芳”的转换/颠换分别为 1.93和 1.84。 川核昔酸的组成及碱基使用偏好性:基因组的碱基组成位于中等,AT含挝较高。 4.中国野桑蚕mtDNA中各类基因的分析: 山蛋白质编码基因:共编码了13个疏水蛋白质,3715个氨基酸。5个起始子为ATG。,7个ATA,1个不明;12个终止子为TAA,l个不明。非极性氨基酸占主导地位,其次是极性不带电的氮基酸。编码线粒体DNA的基因时存在较大的AT偏好性,且更偏好使用T碱基。密码子的各位置组成中T和A含量较高,G和C含量较低。 (2)tRNA的组成及H级结构预测:中国野桑蚕线粒体DNA序列与所比较的其他物种有所不同,包含了24个tRNA,有3个tRNA-Ser,2个tRNA-lie和2个tRNA-Leu,其他17种tRNA都只有一个,并推测出各种H级结构。有17对碱基错配,3对难以匹配,还有1种有四个茎环结构的tRNA(见图13)。大多数密码子序列与相应的反密码子不完全匹配。 (3)rRNA基因及其二级结构预测:有大小两个rRNA,LrRNA和SrRNA,其长度分别是1350hp和784hP。这两个基因与家蚕蛾科的其它各序列相比相似性最高,其次是果蝇和蚊子与人的相似性较低。在自由能最低时,LrRNA基因二级结构有68个主干和69个环状结构组成;SrRNA基因二级结构有9个主干和 10个环状结构组成。 5.中国野桑蚕线粒体基因组的系统分析: O)基于COI部分基因的系统分析发现:日本野桑蚕聚为一类,再与中国安康地区野桑蚕和韩国野桑蚕聚为一类。中国镇江的野桑蚕与家蚕品种C-108聚在一起。其他家蚕品种聚为一类。 (2)基于线粒体基因组和基因的基因树构建与分析发现:分别对6个材料(4个家蚕品种和2个野桑蚕)的线粒体基因组全序列、13个蛋白质编码基因、2个 rRNA基因和 1个非编码区(即 AT富集区)进行了分析,并用 NJ法构建了基因树。从构建的基因树中可知,COI、COil、ATPases、AT宫集区、ND、ND3、ND4L、NDS、COlll、ATPase6的基因树与全基因组的系统树树型基本一致,但在家蚕中也存在品种间的差异;在基因树中还有一些基因,如 cytb、NDZ、ND4、ND6、LrRNA fi SrRNA中野桑蚕和家蚕之间进化规律不太清楚。 由此而知,从线粒体角度可以证明家蚕与中国野桑蚕亲缘关系较近。由于线粒体基因的遗传具有母性遗传的特点,又由于野桑蚕只受自然环境作用,家蚕品种受囱然选择和人工选择的双重作用,从而系统演化过程表现出一定的差异。
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全文目录
扉页 2-8 中文摘要 8-10 英文缩略 10-11 1 文献综述 11-27 1.1 线粒体的生物学基础 11-12 1.1.1 线粒体的形态、功能和组成 11-12 1.2.2 线粒体的起源研究 12 1.2 线粒体基因组的研究进展 12-23 1.2.1 线粒体基因组多态性研究 12-13 1.2.1.1 线粒体基因组的形态多态性 12-13 1.2.1.2 线粒体基因组的大小多态性 13 1.2.1.3 线粒体基因组基因的存在方式 13 1.2.2 线粒体基因组的组成和结构研究 13-15 1.2.2.1 线粒体基因组成特点 13-14 1.2.2.2 线粒体基因结构特点 14-15 1.2.3 mtDNA的复制和表达调控研究 15-16 1.2.3.1 mtDNA的复制 15 1.2.3.2 mtDNA的转录与转录后加工 15-16 1.2.3.3 线粒体蛋白质基因的翻译 16 1.2.3.4 线粒体基因表达产物的定位和功能 16 1.2.4 线粒体基因组与核基因组的关系研究 16-17 1.2.4.1 核基因组对线粒体基因表达的调控 16-17 1.2.4.2 线粒体基因组对核基因的反馈调节 17 1.2.5 线粒体基因组的遗传研究 17 1.2.6 线粒体基因组的分子系统学研究 17-23 1.2.6.1 mtDNA的进化特点 17-20 1.2.6.2 mtDNA在分子系统学上的应用 20 1.2.6.3 mtDNA在系统学上的优缺点 20-21 1.2.6.4 mtDNA系统学常用的分析方法和分析软件 21-23 1.3 绢丝昆虫线粒体基因组的研究进展 23-27 1.3.1 主要绢丝昆虫线粒体及其特征 23-25 1.3.2 绢丝昆虫线粒体全基因组的研究概况 25-26 1.3.3 绢丝昆虫线粒体部分基因及其研究概况 26-27 2 引言 27-29 2.1 中国野桑蚕线粒体基因组研究意义 27-28 2.2 论文研究的主要目的 28 2.3 论文的思路和实验方案 28-29 3 中国野桑蚕线粒体基因组全序列测定和分析 29-63 3.1 材料与方法 29-33 3.1.1 材料、主要设备、生化试剂和分析软件 29-30 3.1.1.1 供试材料及其处理 29 3.1.1.2 主要仪器设备 29 3.1.1.3 主要生化试剂 29-30 3.1.1.4 主要分析软件 30 3.1.2 方法 30-33 3.1.2.1 mtDNA的提取方法 30-32 3.1.2.1.1 材料处理方法 30 3.1.2.1.2 提取方法 30-31 3.1.2.1.3 浓度和纯度的检测方法 31-32 3.1.2.2 各片段的扩增 32 3.1.2.3 克隆方法 32 3.1.2.4 测序方法 32-33 3.1.2.4.1 测序体系与反应条件 32-33 3.1.2.4.2 全序列的拼接 33 3.1.2.4.3 全序列的分析方法 33 3.2 结果与分析 33-63 3.2.1 提取中国野桑蚕线粒体DNA的方法探讨 33-35 3.2.1.1 从不同温度的下保存的野桑蚕蛹获得mtDNA的比较 33-34 3.2.1.2 用不同的破碎组织细胞方法破碎野桑蚕蛹获得的mtDNA比较 34-35 3.2.2 引物的筛选和分析 35-38 3.2.3 测序拼接及其全序列分析 38-47 3.2.3.1 中国野桑蚕线粒体基因组总体分析 38-47 3.2.3.1.1 基因组成和结构排列 38-40 3.2.3.1.2 酶切图谱分析 40-42 3.2.3.1.3 线粒体基因组全序列的分析 42-47 (1) 基因组成和排列的整体比较 42 (2) 全序列中突变的比较 42-44 (3) 核苷酸的组成基建及使用偏好性比较 44-45 (4) 与日野和夏芳线粒体基因组限制性酶切图谱比较 45-47 3.2.4 中国野桑蚕mtDNA中各类基因的分析 47-57 3.2.4.1 蛋白质编码基因 47-50 3.2.4.1.1 中国野桑蚕mtDNA密码子的利用情况 47-48 3.2.4.1.2 中国野桑蚕蛋白编码基因的密码子的位置碱基组成及含量 48-49 3.2.4.1.3 中国野桑蚕与其它物种蛋白编码基因密码子各位置碱基组成比较 49-50 3.2.4.2 tRNA的组成及二级结构分析 50-55 3.2.4.3 rRNA基因及其二级结构的预测 55-57 3.2.5 中国野桑蚕线粒体基因组的系统分析 57-63 3.2.5.1 基于COI部分基因序列的系统学分析 57-59 3.2.5.2 基于线粒体基因组和基因的基因树构建和分析 59-63 4 讨论 63-68 4.1 不同方法对线粒体DNA的提取影响 63 4.2 线粒体基因组tRNA的二级结构变化及特征 63-64 4.3 线粒体基因组的组成和结构排列比较分析 64 4.4 限制性内切酶酶切图谱分析 64-65 4.5 线粒体基因组各种系统树分析 65 4.6 中国野桑蚕、日本野桑蚕和家蚕的关系 65-68 5 小结 68-69 参考文献 69-77 英文摘要 77-81 附录1: 中国野桑蚕线粒体基因组及基因标记 81-94 附录2: 与日本野桑蚕和加餐品种“夏芳”比较的 94-110 附录3: 研究生期间发表的论文 110-111 致谢 111
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 蚕桑 > 其他蚕类
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