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HHV-8 ORF50基因截短片段、vIL-6和gL全长基因的表达及抗ORF50和vIL-6合成肽多抗的鉴定

作　者: 徐静
导　师: 卢春
学　校: 南京医科大学
专　业: 微生物与免疫学
关键词: HHV-8 ORF50 VIL-6 gL
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)又称卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),感染主要与卡波济肉瘤(Kaposi’s sarcoma,KS)、原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)和多中心卡斯特莱曼病(multicentric Castleman’s disease,MCD)等肿瘤的形成相关。HHV-8 ORF50蛋白在病毒从潜伏到增殖状态的转换中起着“分子开关”的作用;病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,vIL-6)能诱导细胞增殖,从而促进KS等疾病的发展;包膜糖蛋白gL(glycoprotein L)参与HHV-8对靶细胞的特异性识别及吸附,最终使病毒核衣壳进入细胞内。本研究的目的是克隆HHV-8 ORF50基因的截短片段、vIL-6和gL全长基因,将他们置于大肠杆菌中作融合表达并纯化融合蛋白,为进一步制备相应的单克隆抗体和研究其功能打下基础;同时,还尝试制备了ORF50和vIL-6的合成肽多克隆抗体,并验证了多抗的特异性。1. ORF50基因截短片段、vIL-6和gL全长基因的克隆与表达。分离、克隆了ORF50基因三个截短片段和vIL-6及gL全长基因,测序和比对结果显示与GenBank中已登记的目的基因序列呈100%的同源;通过pGEX原核表达载体系统获得GST融合表达蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测显示融合蛋白表达正确。2. gL融合蛋白表达包涵体的变性复性与vIL-6融合蛋白表达产物的纯化。gL融合蛋白表达包涵体经高浓度尿素溶液溶解变性和低温透析缓慢复性后行SDS-PAGE,结果提示获得可溶性的融合蛋白。以亲和层析法纯化gL和vIL-6融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果显示:获得vIL-6/GST纯化蛋白。3.vIL-6全长蛋白和ORF50羧基端蛋白二级结构、B细胞抗原表位的预测及多克隆抗体的验证。应用DNAStar Protean软件对vIL-6全长蛋白和ORF50羧基端蛋白二级结构及B细胞抗原表位进行分析和预测,分别选中ORF50羧基端第527～539位氨基酸(amino acides,aa)、667～691aa和vIL-6第89～101aa、137～148aa,人工合成多肽,并将这些多肽与血蓝蛋白(keyhole limpet hemacyanin,KLH)偶联,免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,用Western blot方法验证这些多抗的特异性。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
前言  8-10
第一部分 HHV-8 ORF50 基因截短片段、vIL-6 和gL 全长基因的克隆与表达  10-34
  引言  10
  材料与方法  10-22
  结果  22-31
  分析和讨论  31-34
第二部分 HHV-8 gL 融合蛋白表达包涵体的变性复性与vIL-6 融合蛋白表达产物的纯化  34-47
  引言  34
  材料与方法  34-39
  结果  39-43
  分析和讨论  43-47
第三部分抗 ORF50 和vIL-6 合成肽多克隆抗体的鉴定  47-57
  引言  47
  材料和方法  47-49
  结果  49-55
  分析与讨论  55-57
结论  57-58
参考文献  58-63
综述  63-72
  参考文献  69-72
攻读硕士学位期间公开发表的学术论文  72-73
致谢  73

HHV-8 ORF50基因截短片段、vIL-6和gL全长基因的表达及抗ORF50和vIL-6合成肽多抗的鉴定

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