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NP30单特异性双链抗体的制备及对血吸虫病的治疗作用

作 者: 朱晓娟
导 师: 冯振卿
学 校: 南京医科大学
专 业: 病理学与病理生理学
关键词: 日本血吸虫 抗独特型抗体 双链抗体 虫卵肉芽肿 肝脏纤维化 血吸虫病
分类号: R532.21
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


血吸虫病是一种严重危害人体健康的人兽共患寄生虫病。目前虽然吡喹酮的治疗可以取得可靠疗效,但长期使用可能出现耐药性[1,2],同时急性血吸虫感染的死亡时有发生,慢性血吸虫病肝脏纤维化尚无有效的治疗方法。血吸虫慢性感染动物血清中存在着天然产生的抗独特型抗体(AId),Olds[3]根据AId的免疫调节作用,将日本血吸虫慢性感染小鼠血清用于急性感染小鼠的治疗,研究结果表明AId可降低急性虫卵肉芽肿反应和急性血吸虫感染的死亡率,提示抗独特型抗体有可能用于急性血吸虫感染的治疗。管晓虹等[4]建立了一株日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30,为肠相关抗原(GAA)的内影像抗独特型抗体,可替代虫源抗原用于血吸虫病免疫诊断[5]和疫苗的研究[6],并对虫卵肉芽肿和肝纤维化具有负调节作用[7],可明显减轻血吸虫病造成的宿主免疫病理损害,证明NP30具有抗感染免疫和抗病免疫的双重功效。许静等[8]将NP30用于急性血吸虫感染的治疗,实验结果表明NP30可延长血吸虫感染小鼠的生存时间,降低虫卵肉芽肿反应。但NP30为鼠源性单抗,作为异种蛋白用于人体可产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)[9],从而限制了它在人体内的应用。近年来随着基因工程抗体技术的发展,可将鼠源性抗体进行改造,以减轻其对人体的免疫病理损害。双链抗体(Diabody)是一种小分子抗体,去除了抗体的恒定区,很大程度上降低了抗体的鼠源成分。本研究在NP30的基础上,构建、表达NP30的基因工程抗体—单特异性双链抗体,并建立小鼠血吸虫自然感染模型,观察NP30双链抗体对血吸虫病的治疗作用。材料与方法1.从鼠源性抗独特型抗体NP30杂交瘤细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA。以cDNA为模板,设计引物,扩增NP30重链可变区(VH),轻链可变区(VL),用overlap PCR法扩增双链抗体基因VH-GGGGS-VL,送公司测序验证其正确性。2.将双链抗体基因VH-GGGGS-VL重组入原核表达载体pBAD/gIII,表达质粒转化E.coli TOP10F’,左旋阿拉伯糖诱导表达。对表达的Diabody进行分离纯化,ELISA检测纯化的Diabody与血吸虫病人血清抗体的结合活性。3.建立小鼠血吸虫自然感染模型,随机分为3组:○1 Diabody治疗组;○2 NP30治疗组;○3 PBS对照组。感染后第1天、第2周、第4周,Diabody、NP30治疗组分别注射抗体1次,PBS阴性对照组每次注射灭菌PBS。感染后10周将各组存活的小鼠断颈处死,计算各组死亡率、减虫率、减卵率。取小鼠肝脏做石蜡切片, HE染色测量虫卵肉芽肿直径及面积,Masson染色分析肝脏纤维化程度。研究结果1.测序结果表明双链抗体的VH、VL与鼠源性NP30可变区基因序列完全相同,VH大小为351 bp, VL大小为318 bp,证明双链抗体基因构建成功。2.构建了Diabody的原核表达系统,Diabody在细菌超声上清和沉淀内均有表达,分子量大小在34KD左右。对Diabody进行了纯化,ELISA检测纯化的Diabody能够与血吸虫病人血清抗体特异性结合。3.动物实验结果表明,Diabody治疗组、NP30治疗组、PBS对照组的死亡率分别为50%、27.8%、66.7%,Diabody治疗组、NP30治疗组的减虫率分别为19.25%、29.07%,其中NP30治疗组死亡率、成虫数显著低于PBS组(P<0.05)。Diabody治疗组、NP30治疗组减卵率分别为20.53%、49.38%,两组的虫卵计数均显著低于PBS组(P<0.05)。肝脏石蜡切片HE染色,Diabody、NP30治疗组含单个虫卵的肉芽肿平均直径和面积均显著小于PBS对照组(P<0.05),肝脏石蜡切片Masson染色,纤维化半定量分析,Diabody、NP30治疗组肝脏纤维化程度均显著小于PBS组(P<0.05)。结论1.构建并表达了日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体。NP30单特异性双链抗体与其亲本完整抗体分子NP30具有相同的结合活性。2.日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单特异性双链抗体可以抑制虫卵肉芽肿反应,减轻肝脏纤维化程度,提示本实验制备的NP30双链抗体虽不能降低血吸虫感染的死亡率,但可明显减轻血吸虫感染造成的宿主免疫病理损害。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
前言  10-12
第一部分 日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30 单特异性双链抗体的构建、表达及鉴定  12-33
  材料与方法  12-24
  结果  24-31
  讨论  31-33
第二部分 NP30 单特异性双链抗体对血吸虫病的治疗作用  33-40
  材料与方法  33-35
  结果  35-38
  讨论  38-40
研究小结  40-41
参考文献  41-44
综述  44-54
  参考文献  51-54
附录  54-55
  攻读学位期间发表文章情况  54-55
  致谢  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 寄生虫病 > 蠕虫病 > 吸虫病 > 血吸虫病
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