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Toll样受体7在HBV感染中作用及相关机制的研究

作　者: 吴红
导　师: 吴晓蔓
学　校: 广州医学院
专　业: 免疫学
关键词: TLRs HBV Loxoribine HepG2.2.15细胞 PBMC
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


研究背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是一个全球性健康问题。部分人初次感染HBV后不能彻底清除病毒,成为慢性HBV携带者或慢性乙型肝炎患者,甚至发展为肝硬化,肝癌而严重危害人类健康。HBV持续感染与宿主的特异性免疫耐受、干扰素α产生水平低下,T细胞应答不足或浆细胞样树突状细胞减少及功能受损等现象相关,但其确切机制尚有待进一步研究。Toll样受体(TLR)是近年来发现的一类模式识别受体,通过对病原体相关分子模式(PAMP)的识别,在天然免疫和获得性免疫中起着重要桥梁的作用[1]。TLR7是TLR家族的重要成员之一,与其配体结合可以诱导干扰素、白介素和肿瘤坏死因子等细胞因子的产生,发挥抗病毒作用[2,3]。TLR7的激动剂咪喹莫特(IMQ/R-847))和艾沙托立宾(Loxribine的同类物),已分别用于皮肤癌和慢性丙型肝炎的治疗[4,5]。TLR7的另一配体Resiquimod(R-848)可以通过诱导IFN-α,IFN-β的产生显著抑制HBV的复制[2]。TLR7在抗病毒免疫作用中必不可少,而在慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞TLR7表达显著降低[6]。然而,目前国内外关于HBV感染对TLR7表达调控影响的研究甚少,TLR7在乙型病毒性肝炎发病中的作用及机理尚不确定。本研究通过对TLR7介导的体外抗HBV作用和HBV转染对TLR7表达调控影响的研究,阐述TLR7在乙型病毒性肝炎发病中的作用。通过检测TLR7介导的慢性乙肝患者外周血单个核细胞产生IFN-α,IL-12含量的改变,探讨慢性HBV感染对免疫细胞TLR7功能的损伤及意义,阐述TLR7在慢性HBV感染中的作用及可能的机制,以期为TLRs介导的固有免疫的研究提供参考资料,为寻找治疗乙肝的新靶点和新药的开发提供初步实验依据。研究目的1.通过TLR7特异性配体Loxoribine刺激HepG2.2.15细胞株的研究,探讨TLR7介导的体外抗HBV作用及机制。2.通过检测TLR7特异性配体Loxoribine刺激HBV转染前后的HepG2和HepG2.2.15细胞株TLR7的表达,探讨HBV转染对TLR7表达及调控的影响,阐述TLR7在乙型病毒性肝炎发病中的作用。3.通过检测TLR7介导的慢性乙肝患者外周血单个核细胞产生IFN-α,IL-12含量的改变,探讨慢性HBV感染对免疫细胞TLR7功能的损伤及意义,阐述TLR7在慢性HBV感染中作用及机制。研究方法1.选用能稳定分泌HBV颗粒和HBV抗原标志物的HepG2.2.15细胞株为HBV转染的细胞模型,应用ELISA及实时荧光定量PCR法检测TLR7特异性配体Loxoribine对HepG2.2.15细胞HBsAg,HBeAg分泌和HBV DNA复制的抑制作用,探讨TLR7介导的体外抗HBV作用。2. MTT比色法检测TLR7特异性配体Loxoribine刺激对HepG2.2.15细胞的毒性作用。3.流式细胞术检测HepG2,HepG2.2.15细胞株胞内TLR7蛋白的表达水平,及特异性配体Loxoribine诱导对其表达调控的影响。4. ELISA法检测TLR7特异性配体Loxoribine刺激慢性HBV感染患者和健康人外周血单个核细胞产生IFN-α,IL-12含量的改变,评价慢性HBV感染对免疫细胞TLR7功能的影响。研究结果1.在TLR7特异性配体Loxoribine作用下,可有效抑制HepG2.2.15细胞HBsAg的分泌及HBV DNA的复制,对HBsAg分泌的抑制作用呈剂量和时间依赖性。对HBeAg的分泌无抑制作用。2.低浓度Loxoribine对HepG2.2.15细胞生长有一定抑制作用,但随着配体浓度增高,对细胞生长无明显毒性作用。3. HepG2和HepG2.2.15细胞胞内均有TLR7表达,但转染了HBV全基因组的HepG2.2.15细胞胞内TLR7的表达量明显低于未转染的HepG2细胞。TLR7特异性配体Loxoribine诱导后HepG2和HepG2.2.15细胞胞内TLR7表达量均有增加,但差异无统计学意义。4.乙肝病毒携带组及慢性乙肝患者组外周血单个核细胞培养上清液中IFN-α水平明显低于健康对照组;慢性乙肝患者组IL-12水平明显高于健康对照组;乙肝病毒携带组和慢性乙肝患者组间,PBMC培养上清液中IFN-α和IL-12水平无明显差异。5. TLR7特异性配体Loxoribine刺激培养后,健康对照组外周血单个核细胞培养上清液中IFN-α,IL-12水平显著升高,乙肝病毒携带组及慢性乙肝患者组IFN-α,IL-12水平亦均有升高,但差异无统计学意义。结论1.特异性配体Loxoribine有较显著的抗HBV作用,其对HBV的抑制可能是TLR7介导作用于病毒复制及蛋白合成等环节。2. HBV感染抑制了TLR7的表达,特异性配体Loxoribine诱导则可发挥显著的抗HBV作用,即TLR7表达下调可能参与了乙型病毒性肝炎的发病。3.慢性HBV感染患者外周血单个核细胞TLR7功能受损,INF-α产生水平低下, IL-12调节功能紊乱,这可能是导致HBV持续感染的重要原因。

全文目录


缩略词表  3-6
中文摘要  6-9
Abstract  9-13
前言  13-17
第一章 HBV 转染和Loxoribine 刺激对HepG2 细胞 Toll 样受体7 表达的影响  17-34
  前言  17-19
  材料与方法  19-24
  结果  24-30
  讨论  30-33
  小结  33-34
第二章 慢性乙型肝炎单个核细胞TLR7 及IFN-α/IL-12 关系的初步探讨  34-47
  前言  34-36
  材料与方法  36-40
  结果  40-42
  讨论  42-46
  小结  46-47
参考文献  47-52
附图  52-54
综述  54-62
  参考文献  59-62
研究生期间发表论文  62-63
致谢  63-64

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 病毒传染病 > 病毒性肝炎 > 乙型肝炎
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