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【引言】帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病,其主要病理变化是含色素的神经元变性缺失,尤以以黑质致密部多巴胺(Dopamine,DA)能神经元选择性变性缺失为主。虽然PD的病因仍不明确,但已发现一些与其发病相关的危险因素,如遗传,年龄及环境等。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶( 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahy-dropyridine,MPTP)是一种人工合成的神经毒性物质,能使动物和人出现PD症状。MPTP通过其活性代谢产物MPP(+1-methyl-phenyl pyridinium cation)使黑质纹状体DA能神经元受损伤。二苯乙烯苷(2,3,5,4-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)是中药何首乌的有效成分之一。具有抗氧化,清除自由自,抑制单胺氧化酶活性以及改善记忆功能的作用。近年来,TSG的神经保护作用逐渐受到人们的关注。研究证实TSG可改善老年痴呆小鼠的学习记忆能力,具有神经保护作用,但是TSG对MPP~+诱导的DA能神经元损伤是否具有保护作用,目前尚未见报道。本研究选择具有DA能神经元特性的PC12细胞建立体外模型,旨在观察TSG对MPP~+诱导的DA能神经元损伤是否有保护作用,并对其作用机制做初步探讨。【目的】1.建立帕金森病模型,筛选出MPP~+对PC12细胞损伤的有效浓度和TSG对MPP~+损伤PC12细胞的有效保护浓度;2.观察TSG对MPP~+诱导的PC12细胞的影响;3.研究TSG抑制MPP~+诱导PC12细胞损伤的可能机制。【方法】1.设立空白对照组,200,300,500,700,800,1000,1200,1500 mol/L MPP~+浓度组作用于PC12细胞24h;TSG保护作用:筛选实验处理浓度设立正常对照组、MPP~+损伤组(500 mol/L)、不同浓度的TSG预处理组(1,5,10,50,100 mol/L),用噻唑蓝(MTT)比色法检测,最终筛选出最佳TSG预处理组浓度(1,5,10 mol/L);2.设立正常对照组、MPP~+组、不同浓度TSG预处理组(1,5,10 mol/L),用MTT比色试验检测细胞活性;Hoechst 33258染色观察细胞及细胞核形态变化;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡比率;TUNEL染色观察细胞DNA断裂情况;3.通过蛋白免疫印迹观察细胞中caspase-3、p38MAPK的表达。【结果】1. MTT比色法检测显示,与对照组相比,500 mol/L的MPP~+处理24h后细胞活力为48.3±3.6%(P<0.001)。而TSG预处理24h后,再用MPP~+ (500 mol/L)处理24h,与MPP~+组48.3±3.6%相比,1,5,10 mol/LTSG预处理组细胞活力分别上升为57.8±1.2%(P<0.05),74.3±2.7%(P<0.05),86.8±2.0%(P<0.05),但高浓度TSG(50,100 mol/L)对细胞无保护作用;2. Hoechst染色显示,正常细胞核呈蓝色,边缘光滑完整,均匀淡染,MPP~+处理组细胞染色质固缩,细胞核呈致密浓染,显示较强荧光,甚至可见细胞核裂解,出现致密的颗粒荧光。与MPP~+组47.4±2.4%相比,TSG预处理后凋亡率分别降低为31.6±2.3%(P<0.05) , 22.4±1.8%(P<0.05)和13.4±1.1%(P<0.05);FCM结果显示,正常组,MPP~+处理组,TSG( 1,5,10 mol/L)预处理组凋亡细胞率分别为1.5%,35.6%,27.2%,19.1%和13.3%;TUNEL染色显示,与正常对照组4.0±0.6%相比,MPP~+组TUNEL阳性细胞数增加到35.3±1.2%(P<0.01),而TSG组TUNEL阳性细胞数则显著降低,分别降为25.3±1.2%(P<0.01),17.3±0.9%(P<0.01)和11.7±0.9%(P<0.01);3. Western blotting方法检测结果表明,TSG预处理组caspase-3,p38MAPK,p53表达较MPP~+处理组明显减弱。
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