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棕色固氮菌突变种（UW_（45）、DJ_（54）和DJ_（35））的缺失FeMoco钼铁蛋白的纯化、特性鉴定及结晶研究

作　者: 吕玉兵
导　师: 黄巨富
学　校: 中国科学院研究生院（植物研究所）
专　业: 植物学
关键词: 棕色固氮菌突变种(UW45、DJ54和DJ35) nifB的点突变、nifH和△nifE的缺失固氮酶nifB~-MoFe蛋白、△nifH MoFe蛋白和△nifE MoFe蛋白 MnFe蛋白和CrFe蛋白活性结晶微重力
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

一．棕色固氮菌突变种UW₄₅、缺失nifH(DJ₅₄)和缺失nifE(DJ₃₅)突变种的钼铁蛋白的纯化、特性鉴定及结晶研究棕色固氮菌突变种UW₄₅的菌体破碎后，所得粗提物经两次DEAE 52柱层析后得到部分纯的nifB^- MoFe蛋白和Fe蛋白。再经Sephacryl S-300和DEAE柱的进一步纯化，便使nifB^- MoFe蛋白基本达到SDS凝胶电泳纯。SDS-PAGE结果表明，nifB^- MoFe蛋白具有与野生型棕色固氮菌（OP）MoFe蛋白相同的亚基种类和组成。此粗提物可为用NMF抽提的OP MoFe蛋白的FeMoco激活，所得Fe蛋白具有与OP Fe蛋白相似的互补活性，可使OP MoFe的比活性达到2192nmol C₂H₂／min／mg蛋白。Fe Moco可使无互补活性的nifB^- MoFe蛋白与nifB^- Fe蛋白组成具有可观放氢活性的固氮酶，使FeMoco显出的比活性接近文献报道的还原乙炔的最高值。对nifB^- MoFe蛋白的结晶及晶体生长进行了的研究，初步探讨了结晶溶液各组分的种类和浓度、结晶方法和实验操作等与能否出现晶体及晶体的数目、大小、质量、形状和出晶时间等的相互关系。在结晶实验时，一次就得到了国内外尚未报道的该蛋白的短斜四棱柱的棕色晶体。目前所得的最大的晶体的二维边长都为0.1mm。初步结果表明，这种晶体可能就是nifB^- MoFe蛋白的晶体。从棕色固氮菌突变种DJ₅₄中得到了△nifH MoFe蛋白；并参与了棕色固氮菌突变种DJ₃₅的△nifE MoFe蛋白的分离纯化，所用方法与nifB^- MoFe蛋白的分离纯化相似。对这两种突变种蛋白的特性和结晶进行了初步研究。在结晶实验时，也是一次就得到了国内外尚未报道的△nifHMoFe蛋白和△nifEMoFe蛋白棕色闽氮菌突变种山。；、DJ；。和 DJ；＊的缺失 FeMOCOto铁蛋山的纯化、特吐鉴定及结晶研究的晶体。二．新型固氮酶MnFe蛋白和 CrFe蛋白的特性与结晶研究在已有的工作基础上，分离纯化了几批MnFe蛋白和 CrFe蛋白，并用部分纯的ugh－Fe蛋白进行活性互补，分别测定了 MnFe蛋白和 CrFe蛋白的底物还原活性。不断优化MnFe蛋白和 CrFe蛋白晶体生长条件，获得了晶质良好的 MnFe 蛋白和 CrFe蛋白的较大晶体。在2001年的“神舟2号”飞船搭载实验中，MnFe蛋白的出晶率达到100％，所获得的晶体也比地面对照略厚些。继续进行MnFe蛋白和 CrFe蛋白的空间计划的地面匹配实验，以满足对蛋白质样品的要求，以保证宇宙飞船“神舟3号” 的蛋白质搭载实验获得更好的结果。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
第一章引言  9-15
  一、固氮酶生物化学，分子生物学及结构生物学研究  9-13
    1 固氮酶的基本组成结构与基因编码  9-10
    2 固氮酶MoFe蛋白及其与Fe蛋白的固氮酶复合物晶体的结构  10-12
    3 突变种固氮酶的结构与功能研究  12-13
  二、固氮酶生物多样性研究  13-15
第二章材料与方法  15-23
  一、试剂配制  15-17
    1 修改的Burk's培养基  15
    2 奈氏试剂  15
    3 除氧溶液  15
    4 Tris-HCl缓冲液及不同离子强度的厌氧Tris-HCl缓冲液  15-16
    5 测蛋白浓度所用的试剂  16
    6 ATP发生系统  16
    7 蛋白质晶体生长所需的试剂  16-17
  二、实验材料及样品制备  17-20
    1 棕色固氮菌及其突变种的培养  17
    2 酶的分离纯化  17-20
      2．1 突变种UW_（45）固氮酶nifB~- MoFe蛋白和nifB~- Fe蛋白的分离纯化  17-19
      2．2 突变种DJ_（54）固氮酶△nifH MoFe 蛋白的分离纯化  19-20
  三、实验方法  20-23
    1 蛋白质浓度测定  20-21
    2 固氮酶及与异源固氮酶两组分互补的C_2H_2及H~+还原活性的测定  21
    3 电泳分析  21
    4 蛋白质结晶方法  21-23
第三章试验结果与讨论  23-45
  1 突变种nifB~- MoFe蛋白蛋白的分离纯化、特性鉴定与结晶研究  23-31
    1．1 棕色固氮菌突变种UW_（45）培养  23-24
    1．2 突变种nifB~- MoFe蛋白MoFe蛋白的分离纯化  24
    1．3 nifo~- MoFe蛋白的特性鉴定  24-26
    1．4 nifB~- MoFe蛋白结晶研究  26-31
      1．4．1 Hepes缓冲液的浓度  27
      1．4．2 PEG 8000的浓度  27-29
      1．4．3 MgCl_2和NaCl的浓度  29-30
      1．4．4 结晶方法及其实验操作的影响  30-31
  2 突变种△nifH MoFe蛋白和△nifE MoFe蛋白的分离纯化与结晶研究  31-34
    2．1 △nifH MoFe蛋白的分离纯化和特性鉴定  31-32
    2．2 △nifH MoFe蛋白的初步结晶研究  32-33
    2．3 △nifE MoFe蛋白的初步结晶研究  33-34
  3 新型固氮酶MnFe蛋白和CrFe蛋白的研究  34-45
    3．1 新型固氮酶MnFe蛋白和CrFe蛋白特性研究进展  34-37
      3．1．1 MnFe蛋白和CrFe蛋白的亚基组成  34-35
      3．1．2 MnFe蛋白和CrFe蛋白的底物还原活性  35-37
    3．2 新型固氮酶MnFe蛋白和CrFe蛋白的晶体生长进展  37-45
      3．2．1 结晶溶液系统的选择  37-38
      3．2．2 PEG 8000、MgCl_2和NaCl最适浓度组成的筛选  38-42
        （i） PEG 8000  38-40
        （ii） MgCl_2  40-42
        （iii） NaCl  42
      3．2．3 最适的结晶方法  42-45
第四章结论  45-46
参考文献  46-52
缩略语表  52-53
攻读硕士学位期间已发表的的研究论文  53-54
致谢  54-55

棕色固氮菌突变种（UW_（45）、DJ_（54）和DJ_（35））的缺失FeMoco钼铁蛋白的纯化、特性鉴定及结晶研究

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