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Syk在乳腺癌转移中作用的研究

作　者: 李良
导　师: 张雅洁
学　校: 广州医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 乳腺癌 Syk VEGF-C 转移
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景与目的乳腺癌早期极易发生淋巴道转移,淋巴管生成在肿瘤淋巴道转移的进程中发挥至关重要的作用。因此,研究肿瘤淋巴管生成的调控机制将有助于达到抑制肿瘤淋巴道转移的目的。近来研究发现,脾酪氨酸激酶(Syk)与胚胎鼠淋巴管生成密切相关,但其与肿瘤淋巴管生成及淋巴结转移是否相关尚有待进一步研究。本研究首先采用免疫组化法,分析Syk与乳腺癌淋巴结转移的关系,以及Syk、VEGF-C和NFκB三者之间的相关性;其次,采用基因克隆技术使Syk在乳腺癌MDA-MB-231细胞中表达,并检测其对细胞中VEGF-C表达水平及NFκB活性的影响,旨在探讨Syk在乳腺癌淋巴结转移中的作用及机制。方法一、采用免疫组织化学方法检测55例乳腺癌石蜡标本中Syk、VEGF-C、NFκB(p65)的表达情况,分析Syk、VEGF-C、NFκB(p65)表达与患者年龄、组织学类型及淋巴结转移的关系,以及三者之间的相关性。二、提取人乳腺癌MCF-7细胞总RNA,RT-PCR、T克隆扩增Syk基因的编码序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组质粒pcDNA3.1(-)-Syk; XholⅠ、BamHⅠ双酶切以及DNA测序鉴定。三、脂质体介导重组质粒pcDNA3.1(-)-Syk瞬时转染Syk表达缺失的乳腺癌MDA-MB-231细胞。转染后48h收集细胞,RT-PCR、Western blot法检测各组细胞中Syk mRNA及蛋白的表达情况;荧光定量RT-PCR及Western blot法检测各组细胞中VEGF-C mRNA及蛋白的表达水平,并采用ELISA法检测细胞核中NFκB的活性。结果一、55例乳腺癌组织中,Syk、VEGF-C及NFκB(p65)阳性率分别为50.9%,56.4%,81.8%。Syk在淋巴结转移组的阳性率(30.8%)与无淋巴结转移组的阳性率(69.0%)差异具有统计学意义(P<0.05);VEGF-C在淋巴结转移组的阳性率(84.6%)与无淋巴结转移组的阳性率(31.0%)差异具有统计学意义(P<0.05);p65在淋巴结转移组的阳性率(84.6%)与无淋巴结转移组的阳性率(79.3%)差异无统计学意义(P>0.05),而p65在淋巴结转移组的核移位率(57.7%)与无淋巴结转移组的核移位率(27.6%)差异具有统计学意义(P<0.05)。随着Syk表达降低VEGF-C表达增强,二者呈负相关(r=-0.620,P=0.000);随着Syk表达降低p65胞核移位增加,二者呈负相关(r=-0.448,P=0.002);而随着p65胞核移位增加VEGF-C表达增强,二者呈正相关(r=0.310,P=0.036)。二、重组质粒pcDNA3.1(-)-Syk经双酶切证实插入片段的大小、方向均与预期的一致,测序结果显示序列正确率达99.7%,其中碱基的错配未引起氨基酸的改变。三、RT-PCR和Western blot检测显示,重组质粒组表达Syk mRNA和蛋白,而阴性质粒组及空白对照组均不表达Syk mRNA和蛋白。四、荧光定量PCR及Western blot检测结果表明,重组质粒组VEGF-C mRNA及蛋白表达量明显低于空白对照组(P<0.05);而阴性质粒组VEGF-C mRNA及蛋白表达量与空白对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。五、ELISA法检测细胞核中NFκB的活性,结果显示重组质粒组NFκB的活性明显低于空白对照组(P<0.05);阴性质粒组与空白对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论一、通过免疫组化研究初步推测,在乳腺癌中Syk可能通过抑制NFκB的活化下调VEGF-C表达,从而对乳腺癌淋巴结转移起抑制作用。二、成功构建了Syk基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-Syk,并证明其在乳腺癌MDA-MB-231细胞中能够高效表达。三、证实Syk在乳腺癌MDA-MB-231细胞中重新表达后,NFκB的活性降低,与此同时VEGF-C基因表达下调。提示Syk通过抑制NFκB的活化下调VEGF-C表达,从而抑制乳腺癌淋巴结转移。

全文目录

主要英文缩略词  3-4
中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
前言  9-12
第一部分乳腺癌组织中Syk、VEGF-C 的表达与转移的关系  12-16
  一、材料  12
  二、方法  12-14
  三、结果  14-16
第二部分 Syk 基因真核表达载体的构建及鉴定  16-28
  一、材料  16-19
  二、方法  19-25
  三、结果  25-28
第三部分 Syk 对乳腺癌MDA-MB-231 细胞中VEGF-C 表达的调控  28-41
  一、材料  28-30
  二、方法  30-36
  三、结果  36-41
讨论  41-46
结论  46-47
附图  47-52
参考文献  52-58
综述  58-65
  参考文献  62-65
致谢  65-66

Syk在乳腺癌转移中作用的研究

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