学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

内毒素休克小鼠肝脏线粒体差异蛋白质组的鉴定

作 者: 胡水旺
导 师: 姜勇
学 校: 南方医科大学
专 业: 病理生理学
关键词: 荧光差异凝胶电泳 蛋白质组学 质谱 生物信息学 线粒体 内毒素休克
分类号: R459.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2008年
下 载: 32次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
 

内容摘要


脓毒症(sepsis)是感染引起的全身炎症反应症候群,脓毒症的严重并发症-感染性休克(septic shock)是创伤、烧伤和手术后病人最主要的死亡原因之一。统计表明,临床半数的脓毒症是由革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)引起的,在革兰氏阴性菌的细胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),或称为内毒素(cndotoxin),被认为是革兰氏阴性菌引起脓毒症的主要作用分子。LPS广泛作用于机体多组织器官,其中内皮细胞、巨噬细胞和中性粒细胞是最主要的效应细胞,在LPS的刺激下,它们产生大量的细胞因子,即”细胞因子风暴”(cytokine storm),进而引起失控性的炎症级联反应,最终引起内毒素休克、组织损伤和多器官功能障碍(mutiple organ dysfunction,MOD)。过去十年,研究者们致力于研究脓毒症的发病机制,并用内毒素抗体和肿瘤坏死因子等炎症因子的拮抗剂进行了大量的动物实验和临床实验,但均未收到满意的效果,至今脓毒症的死亡率仍居高不下。这都提示我们对脓毒症特别是内毒素休克的认识还有待加深。越来越多的证据显示重要器官的线粒体损伤在脓毒症发生发展中扮演着至关重要的角色,但是其病理生理过程的分子机制仍然未明确。线粒体(mitochondria)是真核细胞非常重要的细胞器,被誉为“细胞能量发动机”。一般呈粒状或杆状,也可呈环形、哑铃形或其他形状,其主要化学成分是蛋白质和脂类。线粒体由内外两层膜封闭,包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个部分。它在细胞内的分布一般是不均匀的,根据细胞代谢的需要,线粒体可在细胞质中运动、变形和分裂增殖。其主要功能是进行氧化磷酸化来合成ATP,为细胞生命活动提供直接能量。线粒体除了为细胞提供能量外,还在细胞内氧自由基的生成、细胞凋亡、细胞信号转导、细胞内离子的跨膜转运以及电解质稳态平衡的调控等过程中发挥着至关重要的作用。许多实验证实,线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关,如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症。尤其是在神经退行性疾病方面,线粒体蛋白质的研究日益受到关注。内毒素休克早期究竟线粒体发生了哪些功能事件?其具体分子机制如何?目前所知有限。这些问题的解答,对从分子水平加深脓毒症发病机制的认识是有益的。然而内毒素休克过程中线粒体发生的功能事件最终是由蛋白质来执行的。是哪些蛋白发生了改变昵?差异蛋白质组学方法可以揭开这一神秘的面纱。差异蛋白质组学能通过比较样本间蛋白质表达水平的变化,寻找差异分子,用以解决各种各样的生物学问题。差异蛋白质组学研究技术的不断革新使得从整体上研究线粒体蛋白质组在生理、病理过程中的变化成为可能。目前己涌现出许多新颖的差异蛋白质组分析方法,其中荧光差异凝胶电泳(difference gelelectrophoresis,DIGE)技术由于继承了二维凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)的高分辨率,同时又具备高重现性、高灵敏度、高通量和高动态范围等优势,使得DIGE日益受到关注,成为最受欢迎的定量蛋白质组学研究手段之一。DIGE是一种在2-D电泳之前进行荧光染料标记蛋白样品的方法,通过对不同的蛋白样品用不同的荧光染料进行标记,在同一块双向凝胶中可同时分离多至三种不同的蛋白样品,并且每块胶上又引用了内标,内标的利用进一步增加可信度,确保结果能反映出真实的生物学差异,避免了系统误差实验结果的影响,从而能够对样品间蛋白质丰度差异进行精确分析。DIGE系统最大的优点就是整合了CyDye DIGE染料多重标记方法与DeCyder 2D差异分析软件的优势。DeCyder 2D差异分析软件利用了共找点检测的算法,能对荧光图像进行自动检测、背景消除、定量、归一化以及凝胶内匹配,避免了人为因素的影响,消除了不同操作者带来的系统误差。既然DIGE具有如此多的优点,那么利用此技术平台将有很大机遇来揭示内毒素休克小鼠肝脏线粒体差异蛋白质组所蕴藏的信息,为深入研究脓毒症的分子机制提供新的方法。本实验首先建立了一套基于荧光差异双向电泳分离技术-基质辅助激光解析离子化-飞行时间/飞行时间质谱仪鉴定技术(matrix assisted laser desorptionionization-time of flight/time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF)-生物信息学分析技术(bioinformatics)的差异蛋白质组学技术平台,并且对其灵敏度和重现性进行了考察。然后复制了BALB/c小鼠内毒素休克模型,取LPS刺激1小时(hour,hr)组和正常对照组小鼠,麻醉后取其肝脏,利用差速离心和密度梯度离心方法来提取纯化肝脏线粒体,并裂解得到线粒体的全蛋白,用DIGE技术建立了内毒素休克早期小鼠肝脏线粒体差异蛋白质组表达谱,通过DeCyder 2D差异分析软件分析后找到差异蛋白点26个,表达上调和下调的各13个。对这些差异蛋白点利用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行蛋白质鉴定,共鉴定出22种蛋白质。这些差异蛋白的同时出现,必定意味着它们之间有着直接或间接的联系,如何找到它们之间的联系,并且挖掘出这些联系在内毒素休克肝脏线粒体中的病理生理学意义,得出一个框架性的认识,为进一步深入的研究指明道路,这也是目前功能蛋白质组学十分关注和亟待解决的问题。而生物信息学(bioinformatics)可以作为解决这个问题的有用工具。我们首先对鉴定的差异蛋白进行亚细胞定位分析,利用亚细胞定位软件WoLF PSORT进行检索。结果完全定位于线粒体内的有2个;既可定位于线粒体内,又可定位于胞浆的有8个;既可定位于线粒体内,又可定位于其它多个亚细胞器的有6个;在其它亚细胞结构定位,但是没有定位于线粒体内的有10个。这也说明线粒体的提取是成功的。通过定位分析后,我们分别对蛋白质进行功能分析,利用蛋白质数据库的蛋白质结构域(domain)和模体(motif)的分析,粗略地对鉴定的蛋白质进行功能分组,把这些差异蛋白功能主要归纳为以下5类:参与蛋白质和脂质代谢;参与能量代谢;参与氧自由基生成调节;参与细胞凋亡;参与细胞信号转导。然而仅仅以此,还不能达到了解蛋白质间相互关系的目的,还需要对蛋白质间的相互作用进行预测和分析。我们利用String蛋白相互作用数据库对这22种蛋白进行了一级相互作用(直接作用)的分析,结果发现这些蛋白质中,有2组蛋白质是发生直接的相互作用的。其中一组是非特异脂质转移蛋白(Sterolcarrier protein 2,Scp-2)与植烷酸氧化酶(lupus nephritis-associated peptide 1,Ln1),这两个蛋白均在线粒体内有定位,在LPS刺激1小时后线粒体内均表达下调,且下调倍数一致,为-2.0左右。这两个蛋白质形成的复合物可能参与维持脂肪酸代谢的调节。另外一组是白蛋白(serum albumin,Alb)、α-1-抗胰蛋白酶1-1(α-1-antitrypsin 1-1,Aat2)和甲状腺素转运结合蛋白(Transthyretin,Ttr),它们在LPS刺激1小时的线粒体内含量同时上调,且上调倍数均在2.0左右。通过软件预测三者都定位在血浆中,在线粒体内没有定位,而通过文献检索发现Ttr在炎症刺激下的血浆中是表达量减少的,而我们在线粒体内却出现了三者含量同时增加的现象,这是一个非常有意义的发现。我们推测在LPS刺激下三者可能以某种功能复合物的形式由血浆转位入线粒体,参与细胞对内毒素的应激反应。通过研究,我们得出以下五点结论:1.建立了DIGE技术平台,为实验室进行差异蛋白质组学研究提供了一种高可信度、高重复性的技术系统。2.成功提取并纯化得到小鼠肝脏线粒体,并进行透射电镜验证。3.建立了正常和内毒素休克早期BALB/c小鼠肝脏线粒体蛋白质组的差异双向电泳图谱。4.用差异软件分析得到26个差异蛋白点,并进行质谱鉴定,结果鉴定出22种差异蛋白质。5.对22种差异蛋白质进行生物信息学分析,预测出2个有直接相互作用的蛋白质-蛋白质复合物。通过实验技术方法的探索,我们建立了一套基于DIGE分离-MALDITOF/TOF质谱鉴定-生物信息学分析的差异蛋白质组学技术系统,并将其成功地应用于内毒素休克早期小鼠肝脏线粒体差异蛋白质组学分析。这不仅为揭示生命过程的分子基础提供了新的技术方法,而且也为深入研究脓毒症的发病机制及其防治策略提供了新的机遇。

全文目录


摘要  3-7
ABSTRACT  7-14
前言  14-18
第一章 内毒素休克早期小鼠肝脏线粒体荧光差异蛋白质组图谱的建立  18-36
  1.1 材料  18-23
    1.1.1 主要试剂和试剂盒  18-19
    1.1.2 主要配制的试剂  19-22
    1.1.3 实验动物  22
    1.1.4 主要仪器设备  22-23
  1.2 方法  23-28
    1.2.1 BALB/c小鼠内毒素休克早期模型的制备  23
    1.2.2 小鼠肝脏线粒体的粗取、纯化及鉴定  23-24
    1.2.3 线粒体蛋白质的提取  24
    1.2.4 线粒体蛋白的纯化、定量和CyDye染料标记  24-25
    1.2.5 双向凝胶电泳  25-26
    1.2.6 分析胶的成像及图像分析  26
    1.2.7 制备胶的制作  26-27
    1.2.8 制备胶考马斯亮蓝蛋白染色以及扫描  27
    1.2.9 用分析软件匹配差异点并进行挖胶  27-28
  1.3 结果  28-34
    1.3.1 蛋白定量结果  28-29
    1.3.2 线粒体电镜图像结果  29-31
    1.3.3 分析胶扫描图像  31
    1.3.4 制备胶图像  31-32
    1.3.5 DeCyder 2D软件分析找到的差异点  32-34
  1.4 讨论  34-36
第二章 内毒素休克早期线粒体差异蛋白质组的鉴定和生物信息学分析  36-49
  2.1 材料  36-37
    2.1.1 主要配制的试剂  36
    2.1.2 主要试剂和耗材  36-37
    2.1.3 主要仪器  37
    2.1.4 主要数据库或生物信息学网站  37
  2.2 方法  37-40
    2.2.1 DIGE分离后找到的差异蛋白胶粒质谱鉴定前的处理  37-38
    2.2.2 质谱鉴定  38
    2.2.3 生物信息学分析  38-40
  2.3 结果  40-46
    2.3.1 蛋白质的质谱鉴定  40-42
    2.3.2 蛋白质亚细胞定位分析  42
    2.3.3 蛋白质结构域与模体及其功能分类  42
    2.3.4 主要差异蛋白形成的复合物分析  42-46
  2.4 讨论  46-49
第三章 全文小结  49-50
参考文献  50-55
在读硕士期间发表的论文  55-56
综述  56-66
缩略词表  66-68
致谢  68-69

相似论文

  1. BioLab面向生物计算服务的网格系统,TP399-C8
  2. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  3. 天然迈克尔反应受体分子的快速发现及活性研究,R284
  4. 松萝酸与依托红霉素致肝脏毒性的GC-MS代谢组学研究,R965
  5. 西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究,S968.3
  6. 微波加热焚烧法处理沥青烟气的研究,X701
  7. 南京地区西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)的发生调查及其线粒体基因组研究,S433
  8. 棉花纤维初始发育的磷酸蛋白质组学研究,S562
  9. 乳糖衍生物Gu-4对内毒素休克小鼠的治疗效应及其机理研究,R459.7
  10. 高温蛋白酶Pgsey及解旋酶Htc16特征的初步研究,Q814
  11. 烟草花粉管内吞作用机制的细胞学和蛋白质组学研究,Q942
  12. 溶藻弧菌耐四种抗生素的蛋白质组学研究,S941
  13. 蛋膜固相萃取在环境水样微量金属元素分析中的应用,X832
  14. 碳纳米材料在痕量元素分离富集与分析中的应用研究,TB383.1
  15. 红曲霉洛伐他汀生物合成相关基因克隆与分析,TQ927
  16. 寄主型和迁飞型棉蚜在交配行为、mtDNA与共生菌相关基因上的分化,S433
  17. 除草剂溴苯腈与硝磺草酮在玉米和土壤中的残留研究,S481.8
  18. 八种昆虫转录组数据中OBP、CSP和RyR基因预测及序列分析,S433
  19. 一个芥菜型油菜品种资源的线粒体基因组序列分析,S565.4
  20. 甘蓝型油菜线粒体DNA提取及基因表达分析研究,S565.4
  21. 甘蓝型油菜种质资源芽期和苗期耐盐性鉴定与双向电泳体系的建立,S565.4

中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 治疗学 > 急症、急救处理
© 2012 www.xueweilunwen.com