学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

Pseudomonas syringae致病变种的分子鉴定技术及其应用

作　者: 文艺
导　师: 蒋士君
学　校: 河南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 丁香假单胞菌致病变种分子鉴定 hrpZ基因 16S rDNA ITS
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 96次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

植物病原丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)根据其寄主植物以及所致病害的不同症状被分为许多致病变种(pathovar)。致病变种的鉴定是一项重要的基础工作,通常依据一系列复杂的理化特征等细菌学方法来鉴定。随着分子生物学技术的飞速发展,核酸杂交技术、基因组DNA指纹图谱分析技术、保守基因以及特定基因的序列分析技术,为植物病原丁香假单胞菌基因组种团(genomospecies)的划分以及致病变种的鉴定提供了先进方法。本研究通过分析16S rDNA、16S-23S ITS、hrp基因在丁香假单胞菌致病变种鉴定中的可能作用,并把分子鉴定结果与常规的细菌学鉴定结果相互验证,旨在筛选出适于丁香假单胞菌致病变种快速鉴定的指标分子,建立一整套快速鉴定致病变种的分子鉴定技术体系。本研究所取得的主要结果如下：1.以来自8个丁香假单胞菌致病变种P. s. pv. tomato、P. s. pv. angulata、P. s. pv. tabaci、P. s. pv. syringae、P. s. pv. garcae、P.s. pv. glycinea、P. s. pv. phaseolicola、P. s. pv. maculicola以及相关菌株P. viridiflava、P. gingeri的共16个标准菌株的基因组DNA为模板,利用16S rDNA通用引物进行PCR扩增,得到长度约为1560bp的特异性条带,通过T/A克隆获得含有目标片段的重组质粒,经测序得到了各致病变种16S rDNA基因的近全长序列。序列Blast同源性检索以及序列系统进化分析结果显示：植物假单胞病菌的16S rDNA序列高度保守,适于属以及种水平上的鉴定。丁香假单胞菌的16S rDNA序列更为保守,16S rDNA基因的系统发育分析表明,这一高度保守的16S rDNA基因不能满足丁香假单胞菌致病变种分子鉴定的要求。2.利用16S-23S rDNA的保守序列设计了扩增ITS全长序列的简并引物,以8个丁香假单胞菌致病变种的16个标准菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到长度为750bp的特异性条带。PCR产物分别经限定性内切酶HincⅡ及DdeⅠ酶切片段的RFLP分析表明,丁香假单胞菌的16S-23S ITS同样高度保守,P. syringae 8个致病变种的ITS扩增产物的RFLP图谱没有足够的多态性用来鉴别致病变种,仅有P. gingeri、P. viridiflava与P. syringae各致病变种的ITS-PCR-RFLP图谱明显不同。因此,ITS序列同样不是丁香假单胞菌致病变种分子鉴定的理想指标。3. hrpZ基因是病原细菌所独有的,其编码产物既与致病性又与诱导非寄主的过敏性有关。利用设计的4对hrpZ基因引物,以丁香假单胞菌致病变种P. s. pv. tomato、P. s. pv. angulata、P. s. pv. tabaci、P. s. pv. syringae、P.s. pv. garcae、P. s. pv. glycinea、P. s. pv. phaseolicola、P. s. pv. maculicola及其它相关供试菌株P. viridiflava、P. gingeri的基因组DNA为PCR扩增模板,分析了hrpZ基因的PCR扩增片段长度多态性。结果表明,引物对HrpABF/R能够有效区分全部8个供试丁香假单胞菌致病变种；引物对HrpZ08F/R1与HrpZ359/1115对于P. s. pv. garcae以及相关菌株无特异性扩增结果或者多态性结果。引物对HrpZ09UP/DW对供试菌株也有特异性或多态性扩增结果,且在P. s. pv. syringae不同菌株之间存在条带亮度差异。除引物对HrpABF/R外,引物对HrpZ08F/R、HrpZ09UP/DW与HrpZ359/1115都不能对P. s. pv. angulala和P. s. pv. tabaci进行有效区分,说明了P. s. pv. angulata和P. s. pv. tabaci二者的hrpZ可能相同。与16S rDNA以及ITS相比,hrpZ基因的PCR扩增产物的多态性在致病变种间非常丰富,而且致病变种内的保守性强,扩增结果清晰易辩。hrpZ基因的系统进化分析也表明了该基因是丁香假单胞菌致病变种快速鉴定的理想分子指标。4.常规细菌学鉴定实验表明,细菌形态特征、经典LOPAT以及GATTa等一系列理化鉴定结果与基于hrpZ基因的分子鉴定结果相一致,但基于hrpZ的分子鉴定具有快速、准确、易操作、结果客观等独特优势,说明本研究成功建立了基于hrpZ基因的致病变种分子鉴定技术体系,为植物病原丁香假单胞菌及其致病变种的快速鉴定提供了一个有效策略。5.本研究中多次发现野火致病变种与角斑致病变种在形态学特性、理化特性、PCR扩增特点等十分相似。为了区分二者,利用设计的引物对tabAF/R的特异性扩增区分了P. s. pv. angulata和P. s. pv. tabaci两个致病变种。结果表明野火致病变种P. s. pv. tabaci能够得到片段长度1263bp的特异性条带,而角斑致病变种P. s. pv. angulata则没有该特异性条带。说明能够利用特定基因(即烟毒素编码基因)的扩增策略能够区分开tab+菌株和tab-菌株。6.利用本研究建立的基于hrpZ基因以及tabA基因的分子鉴定技术体系,成功地对豫西烟草细菌性叶斑病进行了病原菌的快速鉴定,最终确定该细菌性叶斑病的病原为P. s. pv. tabaci的tab-菌株(即P. s. pv. angulata),这一鉴定结果同样得到了常规细菌学鉴定的验证与支持。

全文目录

致谢  4-9
摘要  9-11
1 文献综述  11-23
  1.1 植物病原原核生物分类系统以及分类现状  11-13
    1.1.1 植物病原原核生物分类系统的发展  11
    1.1.2 植物病原细菌的现行分类系统  11-12
    1.1.3 植物病原细菌的分类依据的发展变化  12-13
  1.2 植物病原假单胞菌的分布以及分类研究  13-14
    1.2.1 植物病原假单胞菌的分布  13
    1.2.2 植物病原假单胞菌的分类研究  13-14
  1.3 植物病原丁香假单胞菌Pseudomonas syringae的主要成员及其分组  14-18
    1.3.1 植物病原丁香假单胞菌Pseudomonas syringae的主要成员  14-17
    1.3.2 植物病原丁香假单胞菌Pseudomonas syringae的分组  17-18
  1.4 植物病原细菌鉴定方法  18-23
    1.4.1 常规鉴定方法  18-20
      1.4.1.1 表型分析鉴定  18-19
      1.4.1.2 细菌学测定  19
      1.4.1.3 依据烟草过敏性反应鉴定致病性  19-20
      1.4.1.4 基于不同代谢产物的理化鉴定  20
    1.4.2 分子生物学鉴定方法  20-23
      1.4.2.1 基于细菌基因组序列的分子鉴定方法  20-21
      1.4.2.2 基于保守基因序列的分子鉴定方法  21-22
      1.4.2.3 基于特定致病基因以及致病相关基因的PCR鉴定技术  22-23
2 引言  23-24
3 材料与方法  24-33
  3.1 丁香假单胞菌致病变种的分子鉴定  24-29
    3.1.1 材料  24-25
      3.1.1.1 试验所用的培养基及试剂  24
      3.1.1.2 供试菌株  24-25
      3.1.1.3 酶、主要试剂以及主要实验仪器设备  25
    3.1.2 试验方法  25-29
      3.1.2.1 模板DNA的制备  25
      3.1.2.2 基于16S rDNA基因的分子鉴定  25-27
      3.1.2.3 基于16S rDNA-23S rDNA转录间隔区(ITS)序列的分子鉴定  27-28
      3.1.2.4 基于hrpZ基因的分子鉴定  28-29
      3.1.2.5 基于tabA基因的分子鉴定  29
      3.1.2.6 基于hrpZ基因的PCR灵敏性测定  29
  3.2 丁香假单胞菌致病变种的生理生化鉴定  29-32
    3.2.1 材料  30
      3.2.1.1 培养基  30
      3.2.1.2 供试菌株  30
    3.2.2 试验方法  30-32
      3.2.2.1 细菌的形态及培养性状  30
      3.2.2.2 革兰氏测定  30
      3.2.2.3 致病性测定  30
      3.2.2.4 LOPAT试验  30-31
      3.2.2.5 GATTa试验  31-32
  3.3 丁香假单胞菌致病变种的分子鉴定技术的应用——豫西烟草细菌性叶斑病的分离与鉴定  32-33
    3.3.1 病原物的分离  32
      3.3.1.1 组织分离法  32
      3.3.1.2 研磨稀释分离法  32
      3.3.1.3 PBS摇菌分离法  32
    3.3.2 细菌的形态及培养性状  32
    3.3.3 革兰氏反应  32
    3.3.4 病原物的致病性测定  32
    3.3.5 基于hrpZ的分子鉴定  32
    3.3.6 基于tabA基因的分子鉴定  32
    3.3.7 常规生理生化鉴定验证  32-33
      3.3.7.1 LOPAT试验  32
      3.3.7.2 GATTa试验  32-33
4 结果与分析  33-48
  4.1 丁香假单胞菌致病变种的分子鉴定结果  33-44
    4.1.1 基于16S rDNA基因的分子鉴定结果  33-37
      4.1.1.1 16S rDNA基因的PCR扩增结果  33
      4.1.1.2 重组质粒DNA的检测以及插入片段的PCR验证  33-35
      4.1.1.3 测序与序列分析结果  35-37
    4.1.2 基于16S rDNA-23S rDNA转录间隔区ITS序列的分子鉴定  37-39
      4.1.2.1 ITS序列的PCR扩增结果  37
      4.1.2.2 ITS序列的PCR-RFLP结果  37-39
    4.1.3 基于hrpZ基因的分子鉴定结果  39-44
      4.1.3.1 引物对HrpABF/HrpABD分子鉴定结果  39
      4.1.3.2 引物对HrpZ08F/HrpZ08R1分子鉴定结果  39-40
      4.1.3.3 引物对HrpZ09UP/HrpZ09DW分子鉴定结果  40-41
      4.1.3.4 引物对HrpZ359/HrpZ1115分子鉴定结果  41
      4.1.3.5 4对HrpZ基因引物的鉴定结果分析  41-42
      4.1.3.6 基于tabA基因的分子鉴定结果  42-43
      4.1.3.7 基于hrpZ基因的PCR灵敏性鉴定  43-44
  4.2 丁香假单胞菌致病变种的生理生化鉴定结果  44-45
    4.2.1 细菌的形态及培养性状结果  44-45
    4.2.2 革兰氏测定结果  45
    4.2.3 致病性测定结果  45
    4.2.4 LOPAT试验结果  45
    4.2.5 GATTa试验结果  45
  4.3 丁香假单胞菌致病变种分子鉴定以及生理生化鉴定结果的分析  45
  4.4 丁香假单胞菌致病变种分子鉴定技术的应用——豫西烟草细菌性叶斑病的分离与鉴定结果  45-47
    4.4.1 细菌的形态及培养性状结果  45-46
    4.4.2 革兰氏反应  46
    4.4.3 致病性测定  46
    4.4.4 基于hrpZ基因的鉴定结果  46-47
    4.4.5 基于tabA基因的分子鉴定结果  47
    4.4.6 常规生理生化鉴定验证结果  47
      4.4.6.1 LOPAT试验结果  47
      4.4.6.2 -GATTa试验结果  47
  4.5 豫西烟草细菌性叶斑病的分离与鉴定结果  47-48
5 结论与讨论  48-51
  5.1 结论  48-49
    5.1.1 序列高度保守的16S rDNA及16-23S rDNA ITS不适于致病变种的分子鉴定  48
    5.1.2 hrpZ基因因其致病变种间的序列多态性及致病变种内的高度保守性而成为致病变种分子鉴定的理想指标  48-49
    5.1.3 分子鉴定体结果与常规细菌学鉴定不相矛盾  49
    5.1.4 毒素编码基因也是鉴别致病变种的重要分子指标之一  49
  5.2 讨论  49-51
参考文献  51-58
ABSTRACT  58-60

Pseudomonas syringae致病变种的分子鉴定技术及其应用

内容摘要

全文目录

相似论文