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马铃薯microRNA及其靶基因的预测与功能分析

作 者: 李世风
导 师: 司怀军
学 校: 甘肃农业大学
专 业: 作物遗传育种
关键词: 马铃薯 microRNA 计算机预测 靶基因 RT-PCR
分类号: S532
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


MicroRNAs (miRNAs)是一类约21-23 nt的非编码单链小RNA分子。已有研究表明,miRNA所调节的靶mRNA在很多植物的生物合成过程中起到重要作用,参与了根、茎、叶、花的形态发生、信号转导及不同环境的胁迫等。近年来,通过克隆手段和生物信息学方法,在植物上已鉴定出上百种miRNA和它的靶序列,但是主要集中在拟南芥、玉米等一些模式植物中,而且很多miRNA的功能尚不清楚。马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界上主要粮食和蔬菜兼用作物之一。目前通过计算机预测法已获得了80多条马铃薯的miRNAs及其可能调控的靶基因。但与其他生物相比,目前已鉴定的马铃薯miRNA基因还远未达到饱和,而且对它们的生物功能尚不清楚。本研究将利用计算机预测法获得马铃薯新的miRNA,并明确其作用的靶基因,以期有目的地利用miRNA进行马铃薯的遗传改良,从而为进一步培育优质、高效、抗逆的马铃薯新种质奠定理论基础。取得的主要研究结果如下:1.本文根据miRNA序列在植物中的高度保守性,通过拟南芥、水稻、玉米等植物中已知的miRNA序列,与马铃薯的表达序列标签(EST)、基因组测序序列(GSS)以及核酸数据库(nr)中的序列进行比对,最后通过在线比对软件blastx去掉编码序列,共发现32条新的miRNAs,这32条miRNAs前体通过RNAfold分析均可折叠形成miRNA家族的标准二级结构。2.利用新发现的马铃薯miRNAs通过在线软件miRU和miRU2与编码蛋白的数据库比对,通过靶基因预测,共预测到了100个靶基因,这些靶基因分别编码与植物生长发育、新陈代谢、信号转导、转录调节、胁迫反应等相关的蛋白。3.通过对miRNA 167b和miRNA482b两条miRNAs进行RT-PCR实验,发现马铃薯miR167b在芽、茎和根组织中有稳定的表达,而在叶组织中却没有表达。miR482b在马铃薯的芽、叶、茎和根中均有表达,在芽、茎和根中表达丰度比较高,但是在叶组织中表达量非常少,反映了miRNA的组织特异性表达。

全文目录


缩略语表  4-5
摘要  5-6
Summary  6-8
第一章 文献综述  8-23
  1.1 miRNA基因  8-11
    1.1.1 miRNA的发现  8
    1.1.2 miRNA的生物合成  8-11
  1.2 miRNA的特点  11
  1.3 植物miRNA的作用机制  11-12
    1.3.1 miRNA对靶基因剪切  12
    1.3.2 miRNA的翻译抑制作用  12
    1.3.3 miRNA介导的翻译沉默  12
  1.4 miRNA的生物学功能  12-16
    1.4.1 miRNA与植物的生长发育  13-14
    1.4.2 miRNA与环境胁迫和植物病害  14-15
    1.4.3 miRNA与植物激素的调节及信号转导  15-16
  1.5 miRNA的鉴定方法  16-20
    1.5.1 直接克隆法  17
    1.5.2 遗传筛选法  17-18
    1.5.3 生物信息学方法  18-20
      1.5.3.1 同源性搜索法  18-19
      1.5.3.2 基因搜寻法  19
      1.5.3.3 茎环结构邻位搜寻法  19
      1.5.3.4 利用靶序列反向搜寻法  19-20
  1.6 miRNA靶基因的鉴定  20-22
    1.6.1 TargetScan  21
    1.6.2 miRanda  21
    1.6.3 DIANA  21
    1.6.4 PicTar  21-22
  1.7 本研究的目的及意义  22-23
第二章 材料与方法  23-30
  2.1 材料  23-25
    2.2.1 马铃薯  23
    2.2.2 数据库的获得  23
    2.2.3 应用的软件  23
    2.2.4 主要仪器和设备  23-24
    2.2.5 主要的试剂和酶  24
    2.2.6 主要缓冲液的配制方法  24-25
    2.2.7 PCR引物  25
  2.3 方法  25-30
    2.3.1 马铃薯miRNA的预测  25-27
    2.3.2 马铃薯miRNA靶基因的预测  27
    2.3.3 miRNA的PCR实验验证  27-30
      2.3.3.1 总RNA的提取  27-28
      2.3.3.2 RNA的反转录反应  28-29
      2.3.3.3 PCR反应  29
      2.3.3.4 PCR鉴定  29-30
第三章 结果与分析  30-53
  3.1 马铃薯miRNA的计算机预测  30-46
  3.2 马铃薯靶基因的鉴定  46-49
  3.3 马铃薯miRNA的表达分析  49-53
    3.3.1 马铃薯RNA的提取  49-50
    3.3.2 RT-PCR检测结果  50-53
      3.3.2.1 miRNA167b的RT-PCR检测结果  51
      3.3.2.2 miRNA482b的RT-PCR检测结果  51-53
第四章 讨论  53-57
  4.1 鉴定microRNA快速高效的方法-计算机RNA组学  53
  4.2 miRNA靶分子的相关分析  53-56
  4.3 马铃薯miRNA表达分析方法的建立  56
  4.4 miRNA的组织特异性表达  56-57
参考文献  57-65
附录  65-67
致谢  67-68
作者介绍  68-69
导师简介  69-70

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 薯类作物 > 马铃薯(土豆)
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