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CpG DNA对异育银鲫免疫细胞活性诱导作用的研究

作 者: 张柳
导 师: 熊传喜
学 校: 华中农业大学
专 业: 水生生物学
关键词: 异育银鲫 巨噬细胞 外周血白细胞 CpG DNA 呼吸爆发活性 细胞增殖 定量PCR
分类号: S941
类 型: 硕士论文
年 份: 2009年
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内容摘要


近年来的研究发现,细菌基因组DNA利人工合成的含有未甲基化CpG基序的特定寡核苷酸序列(统称为CpG DNA)能够直接或间接刺激人和小鼠等多种高等动物的B淋巴细胞和单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞以及天然杀伤细胞的活化或增殖,是一种具有广泛作用的免疫激活剂。但是关于CpG DNA对鱼类免疫功能调节作用的研究才刚刚起步。本实验首次探讨了6种人工合成的CpG DNA对异育银鲫体外培养的头肾巨噬细胞、外周血白细胞的活化作用。6种序列分别为:①1826(GACGTT);②2006(GTCGTT);③1670(AACGTT);④1670-N(AACGTT,更靠近5’端);⑤1670-D(含2个AACGTT);⑥1670-R(含有反向“CG”序列,即AAGCTT)。在细胞水平上,分别用NBT法检测氧呼吸爆发活性;通过测定NO的含量检测氮呼吸爆发活性;采用MTT法测定外周血白细胞的增殖。在分子水平上,以异育银鲫体外培养的巨噬细胞为研究对象,探讨了人工合成的6种CpG DNA对2种重要的细胞因子IL-1β、IL-12基因表达水平的影响。体外作用24h后分离总RNA,经过RT-PCR扩增获得IL-1β和IL-12 cDNA。采用普通RT-PCR对这2种细胞因子的表达进行定性分析;进而采用荧光定量RT-PCR对这2种细胞因子的表达进行定量分析。结果如下:1.除1670-R外,其余5种CpG DNA都能引起巨噬细胞和外周血白细胞的活化,主要表现为细胞内的氮氧呼吸爆发活性的增加和细胞增殖活性的提高;通过定性分析,IL-1β、IL-12扩增片段明亮清晰,而对照组细胞中几乎扩增不出相应的cDNA;通过定量分析,IL-1β、IL-12的表达量与对照组的相比具有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)差异。反向序列1670-R与对照组相比,没有明显的增强效果。2.1670-D的免疫增强效果最为显著(P<0.01)。3.CpG DNA的免疫增强效果还体现出一定的效应,当浓度为10μg·mL-1时,效果最为显著(P<0.01)。研究结果表明,与在哺乳动物中的作用一样,CpG DNA也是鱼类免疫系统的一种新型有效的免疫调节剂,它能增强鱼体内细胞和体液介导的免疫应答,从而增强机体的抗病能力。同时它也将在减少鱼类病害和增强鱼用疫苗的免疫效力方面有着广泛的应用前景。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略词表  11-13
第一章 文献综述  13-24
  1.CpG DNA免疫活性研究进展  13-23
    1.1 CpG DNA的发现  13
    1.2 CpG DNA的结构特性  13-14
    1.3 CpG DNA的免疫学作用  14-18
      1.3.1 含CpG基序的DNA或ODN的免疫学作用  14-16
      1.3.2 CpG DNA的免疫学作用机理  16-17
      1.3.3 CpG DNA在抗感染免疫中的作用  17-18
    1.4 影响CpG DNA发挥作用的因素  18-20
      1.4.1 寡核苷酸中CpG结构的序列、数量和两个CpG之间的碱基数  18
      1.4.2 不同的CpG基序针对不同的免疫细胞发挥作用  18-19
      1.4.3 甲基化对CpG DNA免疫活性的影响  19-20
      1.4.4 不同抗原对CpG DNA作用的影响  20
      1.4.5 CpG DNA的用量、使用方法以及途径对免疫刺激效果的影响  20
    1.5 CpG DNA在水产养殖中的研究进展  20-23
  2.本研究的目的与意义  23-24
第二章 CpG DNA对异育银鲫免疫细胞活性的调节作用  24-39
  引言  24-25
  1.材料与方法  25-29
    1.1 实验材料  25-27
      1.1.1 CpG DNA的来源——人工合成的CpG ODN  25
      1.1.2 实验鱼  25-26
      1.1.3 常规器材  26
      1.1.4 试剂  26-27
      1.1.5 CpG DNA浓度梯度的设计  27
    1.2 实验方法  27-29
      1.2.1 异育银鲫头肾巨噬细胞的分离和培养  27
      1.2.2 异育银鲫外周血白细胞的分离和培养  27-28
      1.2.3 免疫指标的检测  28-29
    1.3 数据分析  29
  2.结果与分析  29-35
    2.1 CpG DNA对免疫细胞活性的影响  29-32
      2.1.1 CpG DNA对巨噬细胞氧呼吸爆发活性的影响  29-30
      2.1.2 CpG DNA对巨噬细胞氮呼吸爆发活性的影响  30-31
      2.1.3 CpG DNA对外周血白细胞增殖能力的影响  31-32
    2.2 影响CpG DNA免疫效果的因素  32-35
      2.2.1 核心序列CG两端的侧翼序列对CpG DNA免疫活性的影响  32-33
      2.2.2 核心序列的位置和数量对CpG DNA免疫活性的影响  33-34
      2.2.3 核心序列CG颠倒成反向序列GC对CpG DNA免疫活性的影响  34-35
  3.讨论  35-39
    3.1 CpG DNA中核心CG两端的侧翼序列对其免疫活性的影响  36-37
    3.2 CpG DNA中核心序列CG的位置和数量对其免疫活性的影响  37-38
    3.3 CpG DNA中核心CG颠倒成为其反向序列GC对其免疫活性的影响  38
    3.4 CpG DNA的浓度对其免疫活性的影响  38-39
第三章 CpG DNA对异育银鲫细胞因子基因表达的调节作用  39-57
  引言  39-40
  1.材料与方法  40-46
    1.1 实验材料  40-41
      1.1.1 实验鱼  40
      1.1.2 常规器材  40
      1.1.3 实验药品  40-41
    1.2 实验方法  41-46
      1.2.1 异育银鲫免疫因子的体内诱导  41
      1.2.2 异育银鲫头肾巨噬细胞总RNA的提取  41-42
      1.2.3 样品cDNA合成  42-43
      1.2.4 普通PCR  43
      1.2.5 凝胶电泳  43
      1.2.6 荧光定量RT-PCR  43-46
  2.结果与分析  46-55
    2.1 异育银鲫部分免疫基因片段的组织表达结果  46-47
    2.2 标准曲线的建立  47-49
    2.3 荧光定量RT-PCR扩增结果  49-55
      2.3.1 核心CG两端的侧翼序列对CpG DNA免疫活性的影响  51-52
      2.3.2 核心序列的位置和数量对CpG DNA免疫活性的影响  52-54
      2.3.3 核心CG颠倒成为其反向序列GC后对CpG DNA免疫活性的影响  54-55
  3.讨论  55-57
结论  57-58
参考文献  58-67
学习期间发表的论文  67-68
附录  68-70
致谢  70-71

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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