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钙离子激活的钾离子通道在人子宫内膜蛋白水平的表达及其功能研究

作　者: 丁竹筠
导　师: 黄荷凤
学　校: 浙江大学
专　业: 妇产科学
关键词: 子宫内膜 KCa 免疫印记胚胎着床 Tram-34 Apamin MTT
分类号: R714
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

背景钙离子激活的钾通道（KCa）是一类重要的钾离子通道家族，他们能直接介导钙离子信号的传导，改变膜电位，影响细胞的增殖分化。许多细胞都表达KCa，它的重要功能在于受到细胞内第二信使钙离子的影响，改变钾离子的跨膜转运，最终改变膜电位。目前根据他们不同生理、药理特征，以及基因序列的差异，鉴定出三种KCa亚家族。KCa根据其电导的大小分为大电导KCa（Large-conductancecalcium-actirated potassium channel BKCa）；中电导KCa（Intermediate-conductance calcium-activated potassium channel，IKCa）和小电导KCa（Small-conductance calcium-activated potassium channel，SKCa）三类。三种KCa通道都受到细胞内钙离子的调节，但是它们分布在不同的组织，具有不同的功能。BKCa在血管血流的肌源性调节中起着重要作用；IKCa在许多肿瘤细胞的生长调控中起着重要作用；SKCa在神经系统有着丰富的表达，调控大量神经递质的释放。胚胎着床是人类生命形成和持续发育的最关键步骤，但到目前为止，胚胎着床的具体机制还不清楚，近年来有关通道蛋白在子宫内膜中的作用及其与胚胎着床和生长发育的关系已逐渐成为生殖研究领域的新焦点。目前包括Cl^-离子通道，Na⁺离子通道，Ca²⁺离子通道及非离子通道的水通道（Aquaporins）在子宫内膜中的表达，分布和功能的研究已在国内外多家研究室深入展开。2003年Nature Cell Biol发表论文阐明人纤维囊性病患者不孕是与子宫内膜细胞Cl^-离子通道功能降低，导致HCO₃^-分泌减少相关。2006年，首次报道新型通道蛋白-2型水通道（aquaporin 2）在人子宫内膜细胞上表达，并阐明了其分布特点及调节机制。我们知道钙离子在多种细胞中都发挥的重要作用，包括子宫内膜细胞，但是子宫内膜细胞是否表达KCa至今未见任何报道。本研究采用western blot方法检测了BKCa、IKCa、SKCa（SK3）蛋白是否表达于人的子宫内膜细胞，并分析比较三种通道蛋白在增生期和分泌中期的表达差异，推测三种通道在月经周期中所起的作用；同时采用MTT方法，检测分别在IKCa、SK3的特异性抑制剂的作用下，子宫内膜的生长状态，以了解这些通道对子宫内膜细胞的增殖所起的作用。材料与方法1．选取管性不孕拟接受体外受精一胚胎移植（IVF—ET）治疗的妇女，于IVF-ET前一周期行宫腔探查时（体温升高后第5—6天）取子宫内膜作为分泌中期标本（n=16）；另取因子宫肌瘤行经腹子宫次全切除（月经周期第8—10d）子宫内膜作为增生期内膜（n=14），分别采用Western blot方法进行膜蛋白BKCa、IKCa、SKCa（SK3）检测，对western blot结果进行半定量分析。2．我院因子宫肌瘤行经腹子宫次全切除的妇女4例，在离体子宫内膜细胞培养基础上，用MTT法测定在E₂、IKCa的抑制剂Tram-34和SKCa的抑制剂Apamin作用下，子宫内膜其活性的变化。以未加药组的子宫内膜做对照，分别测定作用时间24h，48h，72h，96h后的OD值，绘制生长曲线，选取加药后96小时的OD平均值，进行各组间数据比较分析。采用单因素方差（One-Way ANOVA）、Tukey、t检验的统计学方法进行多组和两组间数据比较分析，检验水准α=0.05，双侧。所有实验数据用SPSS13.0统计软件包进行处理。结果1．BKCa、IKCa、SKCa（SK3）蛋白在人的子宫内膜的增生期和分泌期均有表达2．BKCa、IKCa、SKCa（SK3）蛋白在人的子宫内膜的相对表达量BKCa在人的子宫内膜增生期的相对表达量为0.43±0.05，分泌中期的相对表达量为1.24±0.12，样本具有正态分布，方差齐同性，采用独立样本t检验，p＜0.01，差异具有统计学意义，分泌中期的表达明显高于增生期；IKCa在人的子宫内膜增生期的相对表达量为4.45±0.70，分泌中期的相对表达量为0.95±0.15，样本具有正态分布，方差齐同性，采用独立样本t检验，p＜0.01，差异具有统计学意义，增生期的相对表达量明显高于分泌中期；SKCa（SK3）在人的子宫内膜增生期的相对表达量为4.80±0.76，分泌中期的相对表达量为0.98±0.25，样本具有正态分布，方差齐同性，采用独立样本t检验，p＜0.01，差异具有统计学意义，增生期的相对表达量明显高于分泌中期。3．IKCa的抑制剂Tram-34和SKCa（SK3）的抑制剂Apamin分别对子宫内膜细胞增殖的影响本研究所采用不同的药物与子宫内膜共培养24h，48h，72h，96h后对其活性分析，至加药后72h，子宫内膜细胞在抑制剂的作用下生长减慢。E₂作用24h，48h，72h，96h后子宫内膜细胞的吸光度OD值分别为：0.27±0.03，0.38±0.04，0.58±0.05，0.63±0.04；Tram-34作用24h，48h，72h，96h后子宫内膜细胞的OD值分别为：0.26±0.01，0.33±0.04，0.34±0.04，0.34±0.04；Apamin作用24h，48h，72h，96h后子宫内膜细胞的OD值分别为：0.26±0.02，0.32±0.03，0.38±0.04，0.45±0.03；对照组作用24h，48h，72h，96h后子宫内膜细胞的OD值分别为：0.27±0.03，0.33±0.05，0.40±0.05，0.49±0.03。对于加药96h后各组OD值分别为对照组0.49±0.03，雌激素组0.63±0.04，lumol／LTram-34组0.34±0.04，lumol／L Apamin组0.45±0.03采用One-way ANOVA、tukey统计学方法进行各组间数据比较分析。统计学分析Tram-34组明显低于对照组（p＜0.05）和雌激素组（p＜0.01），Apamin组明显低于雌激素组（p＜0.01），其它各组之间无统计学差异。结论1．KCa在人的子宫内膜细胞上有周期性的表达，是人子宫内膜细胞的重要的离子通道之一。2．BKCa在分泌中期的表达明显高于增生期，推测BKCa可能参与雌孕激素诱导的人子宫内膜细胞分泌中期相关因子的合成与释放。3．IKCa在增生期的表达明显高于分泌中期，且IKCa的抑制剂Tram-34对子宫内膜细胞的生长具有抑制作用，推测IKCa可能参与了子宫内膜细胞的增殖的调控。4．SKCa在增生期的表达明显高于分泌中期，SKCa可能参与了雌激素诱导的子宫内膜细胞的增殖。

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-10
前言  10-13
材料与方法  13-20
结果  20-26
讨论  26-31
结论  31-32
参考文献  32-36
综述一  36-43
综述二  43-49
致谢  49

钙离子激活的钾离子通道在人子宫内膜蛋白水平的表达及其功能研究

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