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基于rDNA ITS-1序列对酿酒酵母属及相关3种子囊菌酵母的系统分类学研究

作　者: 冯光惠
导　师: 郭蔼光；余华顺
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ITS-1序列电泳测序系统发育分析
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

本论文以安琪酵母股份有限公司有代表性的酿酒酵母属中24株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及相关3种子囊菌酵母为研究对象,通过对所选取酵母菌株的核糖体DNA(rDNA) ITS-1序列进行电泳和克隆测序,分析出它们之间的系统学关系。研究表明,以酵母菌株的rDNA ITS-1序列进行琼脂糖凝胶电泳,能把菌株分类鉴定到属的水平;采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能把部分酿酒酵母菌株分类鉴定到种的水平,区别效果较琼脂糖凝胶电泳有所提高;对rDNA ITS-1序列进行克隆、测序,经序列比对后发现,酿酒酵母属中酿酒酵母菌株的ITS-1序列大多数有差异,差异主要表现在ITS-1序列上游的一段Poly-T碱基上,其它处的差异仅是个别碱基的转换或颠换,ITS-1序列长度分布在360-370bp之间,G+C%含量均在35.3%左右。所有序列不同的菌株的ITS-1序列在GenBank上发布,并在NCBI上做BLUST比较,最后鉴定出一株酵母菌不属于酿酒酵母,结合序列比对和进化树分析,确认它属于葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。根据酿酒酵母ITS-1序列的不同,用ClustalX1.8、Phylip3.6等生物软件做进化树分析和系统分类学研究,最后确定了各菌株之间的亲缘关系远近。实验结果也证明ITS-1序列分析方法在酵母公司生产酵母及其发酵生产过程中的应用可行性及其重要作用。用形态特征观察和生理生化测定等常规分类学方法进行酵母菌株的分类鉴定,一般只能分类到属的水平,而且花费的周期长,容易出现分类学上的混乱,导致系统分类的不稳定,常常会给生产上带来很大的障碍,引起巨大的经济损失。近年来,随着生物化学和分子生物学的快速发展,一些分子生物学方法逐渐应用到酵母等真菌及细菌的系统分类学中,从而简化了过去一些复杂的鉴定程序,使各种菌种的系统学地位得到改进和明确,在生产上的应用价值也大大提高。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
第一章文献综述  8-21
  1.1 酵母菌的一般性质和用途  8
  1.2 酿酒酵母属及相关子囊菌酵母属的分类学研究历史与现状  8-19
    1.2.1 酿酒酵母属的建立及早期分类学研究  8
    1.2.2 酿酒酵母属分类系统的演变  8-11
    1.2.3 酿酒酵母属研究新进展  11-12
    1.2.4 对酿酒酵母属与相关子囊菌酵母属分类学关系认识的演变  12-13
    1.2.5 酿酒酵母属分类学研究方法  13-18
      1.2.5.1 常规分类学方法的建立和发展  13-14
      1.2.5.2 化学分类学方法  14-15
      1.2.5.3 分子分类学方法  15-18
    1.2.6 国内酿酒酵母属分类学研究简史及现状  18-19
  1.3 核糖体DNA(rDNA) ITS-1 序列分析  19
  1.4 酵母菌分类的目的和意义  19-21
第二章实验材料与方法  21-30
  2.1 试验材料与仪器  21-24
    2.1.1 菌株来源  21
    2.1.2 生化试剂  21-22
    2.1.3 培养基  22
    2.1.4 溶液配制  22-24
    2.1.5 酶与标准分子量  24
    2.1.6 试验仪器  24
  2.2 试验方法  24-30
    2.2.1 菌种的活化与保藏  24
    2.2.2 基因组DNA 的提取  24-25
    2.2.3 引物设计  25
    2.2.4 PCR 反应及其过程的优化  25
      2.2.4.1 PCR 反应体系  25
      2.2.4.2 PCR 反应过程及其优化  25
    2.2.5 PCR 产物的电泳检测  25-26
      2.2.5.1 琼脂糖凝胶电泳检测  25-26
      2.2.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测  26
    2.2.6 目的片段克隆  26-28
      2.2.6.1 PCR 产物的回收和纯化  26
      2.2.6.2 载体及其与目的片段的连接  26
      2.2.6.3 感受态细胞的制备及其转化  26-27
      2.2.6.4 重组质粒蓝白斑中筛选阳性克隆  27
      2.2.6.5 质粒的提取  27-28
      2.2.6.6 阳性克隆的PCR 检测  28
      2.2.6.7 阳性克隆的双酶切检测  28
    2.2.7 测序  28
    2.2.8 测序结果的验证  28
    2.2.9 序列分析  28-30
第三章结果与分析  30-47
  3.1 酵母菌基因组DNA 的提取  30
  3.2 引物合成  30-31
  3.3 电泳检测  31-33
    3.3.1 琼脂糖凝胶电泳的检测结果  31-32
    3.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测结果  32-33
  3.4 目的片段的克隆  33-34
    3.4.1 阳性克隆的筛选  33
    3.4.2 阳性克隆的PCR 和双酶切验证  33-34
  3.5 测序结果的验证  34-35
  3.6 ITS-1 序列分析  35-44
    3.6.1 各菌株的ITS-1 序列  35-41
    3.6.2 属水平的 ITS-1 序列比较  41
    3.6.3 同一种内不同亚种的ITS-1 序列比较  41-44
  3.7 系统分类学分析  44-47
    3.7.1 不同属之间的聚类分析  44-45
    3.7.2 同一种内不同亚种的聚类分析  45-47
第四章讨论  47-49
参考文献  49-55
致谢  55-56
作者简介  56

基于rDNA ITS-1序列对酿酒酵母属及相关3种子囊菌酵母的系统分类学研究

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