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SIV与SHIV的构建及SIV Gag蛋白的表达纯化和单抗研究

作　者: 万延民
导　师: 李河民；王佑春
学　校: 中国药品生物制品检定所
专　业: 病原生物学
关键词: SHIV 嵌合病毒 SIV Gag蛋白抗Gag单抗
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
下　载: 42次
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内容摘要

SHIV是利用基因重组技术构建的SIV／HIV嵌合病毒，SHIV被广泛用于HIV基因功能和致病机理研究，SHIV／恒河猴还可做为HIV疫苗研究的动物模型。国外科学家自上世纪80年代末开始构建SHIV，目前已有多株SHIV问世，其中部分致病性较强的毒株已经在抗HIV抗体中和活性评价和HIV疫苗攻毒实验中得到了初步应用；但目前国内还没有SHIV的构建报道。在本研究中，首先利用从国外实验室获得的含有SIVmac239 5′端1～6707个碱基的质粒p239SpSp5′和含有SIVmac239 3′端6702～13068个碱基的质粒p239SpE3′，经SphI酶切后连接获得完整的SIVmac239 DNA分子克隆。在分析了HIV-1 B模板中的tat／rev／env基因序列之后，以该序列内部的HindⅢ酶切位点为界，采用巢式PCR方法分两段扩增了HIV-1 B的tat／rev／env基因。以分段扩增产物的酶切连接产物为模板，重新设计引物扩增得HIV-1 B tat／rev／env全长序列，经NcoI和SphI双酶切后，替换到p239SpE3′中，筛选鉴定得阳性克隆子。然后，采取与构建SIVmac239provirus相同的方法构建了SIVmac239／HIV-1B(Thai)嵌合病毒。经酶切及PCR鉴定证实，上述两株病毒在分子水平均已构建成功。 SIVmac239provirus转染MT-4细胞后，提取基因组DNA做模板，采用巢式PCR的方法检测到SIVmac239 pol基因的一段，而做为对照的MT-4细胞培养上清扩增结果为阴性。 PCR扩增了p239SpSp5′质粒中完整的SIVmac239 gag基因，连接到原核表达载体pET-30a(+)，将筛选到的阳性克隆子转化至大肠杆菌BL21(DE3)。经小量诱导表达分析发现，Gag蛋白主要以可溶形式表达，软件分析显示菌体裂解上清中的Gag蛋白占68.6％，沉淀中Gag蛋白占31.4％。在对诱导表达条件进行优化后大量诱导表达，采用Ni离子亲和层析法纯化裂解上清中的目的蛋白，SDS-PAGE电泳后，AlphaeasyFC软件分析显示Gag蛋白纯度为100％。以SIV阳性的猴血清为一抗对纯化后的Gag蛋白进行WB检测，结果显示其具有良好

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-7
前言  7-9
第一部分 SIVmac239provirus与SHIV的构建  9-36
  材料与方法  9-24
  结果  24-31
  讨论  31-35
  第一部分小结  35-36
第二部分 SIVmac239的核心抗原的表达纯化和单抗制备  36-70
  材料与方法  36-48
  结果  48-64
  讨论  64-69
  第二部分小结  69-70
参考文献  70-71
附录1:文献综述  71-85
附录2:缩略词表  85-87
致谢  87

SIV与SHIV的构建及SIV Gag蛋白的表达纯化和单抗研究

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