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一种新的Th2高表达蛋白—嗜中性颗粒蛋白（NGP）的表达、纯化及其性质与功能初探

作　者: 谢德鄂
导　师: 陈季武；孙兵
学　校: 华东师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Th细胞嗜中性颗粒蛋白脾细胞增殖
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

CD4~+T细胞根据其所分泌的细胞因子的不同，可以分成两个亚类：Th1细胞和Th2细胞。Th1细胞主要分泌INF-γ、IL-2、TNF-α和TNF-β，对于细胞内病原体例如单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和利什曼原虫(Leishmania major)的清除十分重要；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-13、IL-5、IL-6、IL-10和IL-9，从而诱导体液反应去清除肠内蠕虫和线虫等寄生虫。体内Th1和Th2的平衡在维护机体免疫状态平衡、调节生理机能、防御感染、监视肿瘤等多方面具有重要的意义。若朝向Th1分化的细胞过量，将导致自身免疫性疾病的发生；反之，若Th2过于活跃，则会导致过敏和哮喘的发生。尽管近几年人们对辅助性T细胞分化的认识有了很大的提高，但仍然存在一些问题。我们实验室应用高通量基因芯片技术对Th1和Th2的基因表达谱进行了研究，结果发现了一种新的Th2高表达基因——嗜中性颗粒蛋白(NGP)基因；并且通过RT—PCR、实时定量PCR进一步确认NGP的确在Th2细胞中的高表达。由此推断NGP可能在辅助性T细胞的分化中发挥某种功能。将NGP克隆入质粒pEGFP-N1后，利用激光共聚焦荧光显微镜技术，发现融合表达的NGP—GFP定位于细胞质中，并且转染了NGP-pEGFP-N1的293T细胞的上清液可以抑制OVA诱导的小鼠脾细胞的增殖。为了进一步对NGP进行功能研究，表达纯化了NGP-GST融合蛋白，同时制备了抗体。经过westernblot验证，在蛋白水平上也证实NGP是在Th2中高表达。由此，可以初步断定NGP为Th2分泌的一种新的细胞因子。进一步对纯化的NGP-GST蛋白进行功能研究表明，所纯化的融合蛋白同样可以抑制OVA诱导的小鼠脾细胞增殖。综上所述，本研究可能发现了Th2分泌的一种新的细胞因子。这种细胞因子具有抑制特异性抗原所引起的脾细胞增殖的功能。

全文目录

中文摘要  6-7
英文摘要  7-10
第一章绪论  10-14
第二章材料与方法  14-37
  2.1 动物、细胞及菌株  14
  2.2 主要试剂  14-20
  2.3 主要仪器  20-21
  2.4 小鼠脾细胞的分离  21
  2.5 辅助性T细胞Th1和Th2的诱导分化  21
  2.6 Th1和Th2细胞分化成熟后的重复刺激  21
  2.7 ELISA(酶联免疫吸附实验)测IL-4和IFN-γ  21-22
  2.8 细胞总RNA的抽提  22
  2.9 引物的设计与合成  22-23
  2.10 RT-PCR  23-24
  2.11 实时定量PCR  24-25
  2.12 重组质粒的构建  25-27
  2.13 细胞培养  27-28
  2.14 脂质体转染  28
  2.15 NGP在细胞内的定位  28-29
  2.16 ~3H-胸腺嘧啶掺入法测脾细胞增殖  29
  2.17 原核表达质粒NGP-pGEX-4t-1的构建  29-30
  2.18 NGP-GST蛋白快速表达  30
  2.19 NGP-GST蛋白小量表达  30-33
  2.20 NGP-GST蛋白大量表达及纯化  33-34
  2.21 NGP-GST抗血清的制备  34
  2.22 ELISA(酶联免疫吸附实验)  34
  2.23 Westernblot印迹  34-37
第三章实验结果  37-47
  3.1 Th1和Th2细胞的获得  37-38
  3.2 NGP在Th2细胞中高表达的确认  38-39
  3.3 NGP在Th细胞分化过程中的表达情况  39
  3.4 重组质粒NGP-pEGFP的构建  39-41
  3.5 NGP的亚细胞定位  41
  3.6 NGP转染的293T细胞的上清液可以抑制脾细胞增殖  41-42
  3.7 NGP的原核表达与纯化  42-45
  3.8 纯化的NGP-GST可以抑制OVA诱导的脾细胞增殖  45
  3.9 蛋白水平上Th2中高表达NGP的确认  45-47
第四章讨论  47-49
  4.1 Th细胞中新的功能基因的发现  47
  4.2 基因在细胞内定位的方法选择  47-48
  4.3 NGP抑制OVA诱导的脾细胞增殖的可能机制  48-49
第五章结论和后继工作  49-50
参考文献  50-54
致谢  54-55
攻读硕士学位期间发表的文章  55

一种新的Th2高表达蛋白—嗜中性颗粒蛋白（NGP）的表达、纯化及其性质与功能初探

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