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重叠延伸PCR(SOE PCR)技术在洛伐他汀九酮合成酶基因克隆中的应用

作 者: 黄卓
导 师: 李东栋
学 校: 海南大学
专 业: 生物化工
关键词: 重叠延伸PCR 洛伐他汀 聚酮合成酶 他汀类药物
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)是一种采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。洛伐他汀(lovastatin,也称莫那可林K,monacolin K)是一种来源于微生物HMG-COA(羟甲基戊二酰辅酶A)还原酶抑制剂,是用于治疗高胆固醇症的药物,它能阻止动脉硬化,减少心肌梗塞等发病的危险,因此在医学上具有重要意义。为了验证重叠PCR技术在洛伐他汀九酮合成酶基因(LOVB)克隆中的应用,本研究设计了4对引物,分别扩增LOVB的4个外显子,并按一定的顺序,利用重叠延伸PCR法将其4个外显子一一串联起来,形成LOVB①-④的cDNA序列,所得的DNA片段经纯化回收后与T克隆载体进行连接,然后转化至大肠杆菌DH5a中,最后用PCR法筛选阳性转化子,并用序列测定的方法鉴定重组质粒。结果表明:重叠延伸PCR成功扩增出了LOVB①-④的cDNA序列,大小1.3kb左右,该序列片段经纯化回收后与T克隆载体进行连接,然后转化至大肠杆菌DH5a中,在含氨苄青霉素(AMP)的LB平板上用PCR法筛选出了阳性菌落,测序结果和NCBI中登录号为AF151722.1的洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④的cDNA序列比对,同源性为98.5%,表明通过重叠延伸PCR技术成功克隆了LOVB①-④的cDNA序列,并获得了洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④-TA重组质粒,为今后毕赤酵母表达洛伐他汀九酮合成酶基因奠定了坚实的基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-9
第一章 前言  9-21
  1 重叠PCR技术的研究进展  9-12
    1.1 重叠PCR技术的建立  9
    1.2 重叠PCR技术的原理  9
    1.3 重叠延伸PCR技术的特点  9-10
    1.4 重叠PCR技术的应用  10-11
      1.4.1 重叠PCR克隆融合基因  10-11
      1.4.2 重叠PCR克隆突变基因  11
      1.4.3 重叠PCR用于基因敲除  11
      1.4.4 重叠PCR扩增目的基因  11
    1.5 展望  11-12
  2 洛伐他汀的研究进展  12-19
    2.1 洛伐他汀的发现  12
    2.2 洛伐他汀的结构和理化性质  12-13
    2.3 洛伐他汀的活性机理和药用价值  13-16
      2.3.1 洛伐他汀的活性机理  13-14
      2.3.2 洛伐他汀的调脂作用  14-15
      2.3.3 洛伐他汀的非调脂作用  15-16
    2.4 洛伐他汀生物合成酶  16
    2.5 洛伐他汀生物合成机理  16-18
    2.6 洛伐他汀生产工艺研究现状  18
    2.7 他汀类药物的市场前景  18
    2.8 他汀类药物展望  18-19
  3 本研究的目的和意义  19-20
  4 本研究的技术路线  20-21
第二章 材料和方法  21-29
  1 实验材料  21-22
    1.1 主要仪器  21
    1.2 菌株  21
    1.3 主要试剂  21-22
    1.4 培养基及实验试剂配制  22
      1.4.1 LB固体培养基  22
      1.4.2 Czapek's液体培养基  22
      1.4.3 土曲霉DNA提取相关试剂  22
  2 实验方法  22-29
    2.1 模板的制备  22-23
      2.1.1 土曲霉菌体的培养  22
      2.1.2 材料处理和粗提  22-23
      2.1.3 纯化  23
      2.1.4 电泳分析  23
    2.2 LOVB基因引物设计  23-24
    2.3 目的DNA片段的获得  24-26
      2.3.1 重叠PCR扩增  24-25
      2.3.2 重叠PCR扩增影响因素的比较  25-26
    2.4 目的DNA片段和T克隆载体的连接  26
    2.5 氯化钙法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞  26
    2.6 大肠杆菌DH5a的转化  26-27
    2.7 转化子的检测和鉴定  27-29
      2.7.1 PCR快速筛选  27-28
      2.7.2 重组质粒的测序  28-29
第三章 实验结果  29-37
  1 土曲霉总DNA的提取  29
  2 目的基因的PCR扩增结果  29-34
    2.1 第一轮PCR的扩增结果  29
    2.2 第二轮PCR的扩增结果  29-31
    2.3 第三轮PCR的扩增结果  31
    2.4 重叠PCR扩增影响因素的比较结果  31-34
      2.4.1 不同退火温度和Mg~(2+)浓度的比较结果  31-32
      2.4.2 三段或两段DNA片段拼接的比较结果  32-33
      2.4.3 直接和间接模板应用的比较结果  33
      2.4.4 模板纯化和不纯化的比较  33-34
  3 重组质粒的菌落PCR鉴定结果  34-35
  4 重组质粒的序列测定结果  35-37
第四章 讨论  37-40
  1 重叠延伸PCR克隆洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④的cDNA序列  37
  2 重叠引物的设计  37
  3 重叠延伸反应条件  37-38
  4 DNA聚合酶的选择  38
  5 PCR产物的纯化回收  38-39
  6 本实验需进一步完善的地方  39-40
第五章 小结  40-41
参考文献  41-45
附录一 培养基和试剂配方  45-47
附录二 琼脂糖凝胶回收步骤  47-48
附录三 质粒的小量提取  48-49
附录四 重组质粒的测序结果  49-59
致谢  59

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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