学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
重叠延伸PCR(SOE PCR)技术在洛伐他汀九酮合成酶基因克隆中的应用
作 者: 黄卓
导 师: 李东栋
学 校: 海南大学
专 业: 生物化工
关键词: 重叠延伸PCR 洛伐他汀 聚酮合成酶 他汀类药物
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 41次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)是一种采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。洛伐他汀(lovastatin,也称莫那可林K,monacolin K)是一种来源于微生物HMG-COA(羟甲基戊二酰辅酶A)还原酶抑制剂,是用于治疗高胆固醇症的药物,它能阻止动脉硬化,减少心肌梗塞等发病的危险,因此在医学上具有重要意义。为了验证重叠PCR技术在洛伐他汀九酮合成酶基因(LOVB)克隆中的应用,本研究设计了4对引物,分别扩增LOVB的4个外显子,并按一定的顺序,利用重叠延伸PCR法将其4个外显子一一串联起来,形成LOVB①-④的cDNA序列,所得的DNA片段经纯化回收后与T克隆载体进行连接,然后转化至大肠杆菌DH5a中,最后用PCR法筛选阳性转化子,并用序列测定的方法鉴定重组质粒。结果表明:重叠延伸PCR成功扩增出了LOVB①-④的cDNA序列,大小1.3kb左右,该序列片段经纯化回收后与T克隆载体进行连接,然后转化至大肠杆菌DH5a中,在含氨苄青霉素(AMP)的LB平板上用PCR法筛选出了阳性菌落,测序结果和NCBI中登录号为AF151722.1的洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④的cDNA序列比对,同源性为98.5%,表明通过重叠延伸PCR技术成功克隆了LOVB①-④的cDNA序列,并获得了洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④-TA重组质粒,为今后毕赤酵母表达洛伐他汀九酮合成酶基因奠定了坚实的基础。
|
全文目录
摘要 4-5 Abstract 5-6 目录 6-9 第一章 前言 9-21 1 重叠PCR技术的研究进展 9-12 1.1 重叠PCR技术的建立 9 1.2 重叠PCR技术的原理 9 1.3 重叠延伸PCR技术的特点 9-10 1.4 重叠PCR技术的应用 10-11 1.4.1 重叠PCR克隆融合基因 10-11 1.4.2 重叠PCR克隆突变基因 11 1.4.3 重叠PCR用于基因敲除 11 1.4.4 重叠PCR扩增目的基因 11 1.5 展望 11-12 2 洛伐他汀的研究进展 12-19 2.1 洛伐他汀的发现 12 2.2 洛伐他汀的结构和理化性质 12-13 2.3 洛伐他汀的活性机理和药用价值 13-16 2.3.1 洛伐他汀的活性机理 13-14 2.3.2 洛伐他汀的调脂作用 14-15 2.3.3 洛伐他汀的非调脂作用 15-16 2.4 洛伐他汀生物合成酶 16 2.5 洛伐他汀生物合成机理 16-18 2.6 洛伐他汀生产工艺研究现状 18 2.7 他汀类药物的市场前景 18 2.8 他汀类药物展望 18-19 3 本研究的目的和意义 19-20 4 本研究的技术路线 20-21 第二章 材料和方法 21-29 1 实验材料 21-22 1.1 主要仪器 21 1.2 菌株 21 1.3 主要试剂 21-22 1.4 培养基及实验试剂配制 22 1.4.1 LB固体培养基 22 1.4.2 Czapek's液体培养基 22 1.4.3 土曲霉DNA提取相关试剂 22 2 实验方法 22-29 2.1 模板的制备 22-23 2.1.1 土曲霉菌体的培养 22 2.1.2 材料处理和粗提 22-23 2.1.3 纯化 23 2.1.4 电泳分析 23 2.2 LOVB基因引物设计 23-24 2.3 目的DNA片段的获得 24-26 2.3.1 重叠PCR扩增 24-25 2.3.2 重叠PCR扩增影响因素的比较 25-26 2.4 目的DNA片段和T克隆载体的连接 26 2.5 氯化钙法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞 26 2.6 大肠杆菌DH5a的转化 26-27 2.7 转化子的检测和鉴定 27-29 2.7.1 PCR快速筛选 27-28 2.7.2 重组质粒的测序 28-29 第三章 实验结果 29-37 1 土曲霉总DNA的提取 29 2 目的基因的PCR扩增结果 29-34 2.1 第一轮PCR的扩增结果 29 2.2 第二轮PCR的扩增结果 29-31 2.3 第三轮PCR的扩增结果 31 2.4 重叠PCR扩增影响因素的比较结果 31-34 2.4.1 不同退火温度和Mg~(2+)浓度的比较结果 31-32 2.4.2 三段或两段DNA片段拼接的比较结果 32-33 2.4.3 直接和间接模板应用的比较结果 33 2.4.4 模板纯化和不纯化的比较 33-34 3 重组质粒的菌落PCR鉴定结果 34-35 4 重组质粒的序列测定结果 35-37 第四章 讨论 37-40 1 重叠延伸PCR克隆洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④的cDNA序列 37 2 重叠引物的设计 37 3 重叠延伸反应条件 37-38 4 DNA聚合酶的选择 38 5 PCR产物的纯化回收 38-39 6 本实验需进一步完善的地方 39-40 第五章 小结 40-41 参考文献 41-45 附录一 培养基和试剂配方 45-47 附录二 琼脂糖凝胶回收步骤 47-48 附录三 质粒的小量提取 48-49 附录四 重组质粒的测序结果 49-59 致谢 59
|
相似论文
- 红曲霉洛伐他汀生物合成相关基因克隆与分析,TQ927
- 耐酸性黑曲霉木聚糖酶XynⅢ的改造和定点突变研究,TQ925
- 长沙市某医院冠心病患者患病现状及患病危险因素研究,R541.4
- 云南红曲中主要活性成分的研究,R284.1
- 他汀类药物在急性心肌梗死患者中使用的安全性,R542.22
- CIP-4的剪接突变现象在肾小管上皮细胞转分化中的作用初探,R692
- 重组人ICOS胞外区原核表达载体的构建及表达,Q78
- 放线菌新抗生素生物合成基因的发掘,S476.8
- 洛伐他汀缓释微丸型片剂的研制,R943
- 利用重叠延伸PCR技术在酿酒酵母中构建木糖代谢相关基因,Q78
- 甘蔗花叶病毒HC-Pro的GFP标记及其蚜传特性,S432.41
- 大容量人源胃癌核糖体展示抗体库的构建、鉴定及筛选,R735.2
- 冠心病他汀类药物治疗与中医证型的相关性,R259
- 引入二硫键提高黑曲霉XynⅢ热稳定性的研究,Q78
- 炎症因子对他汀类药物降脂疗效影响的临床研究,R589.2
- 辛伐他汀对骨髓间充质干细胞增殖及分泌功能的影响,R965
- 不同剂量阿托伐他汀预防对比剂肾病,R692.9
- 脱氢洛伐他汀的降脂及抗炎作用研究,R96
- 利玛原甲藻中聚酮合成酶基因的克隆与表达分析,Q943.2
- 玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素生物合成基因相关线性质粒的研究,Q78
中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
© 2012 www.xueweilunwen.com
|