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多疣壁虎CD59参与断尾再生过程中近远轴的位置记忆

作　者: 王锐利
导　师: 王勇军
学　校: 南通大学
专　业: 神经生物学
关键词: 多疣壁虎 CD59 芽基再生位置信息
分类号: Q42
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

两栖类附肢截断后能够精确地再生出丢失的部分,如美西螈(axolotl)或者蝾螈(newt)的附肢在任何一个截面被横断后,都能再生出相应的结构,如腕部被截断后,能够完全再生出腕部;前臂被截断后,能够再生出完整的新前臂。这种精确再生主要是通过再生芽基细胞表面分子prod1基因(CD59类似物)的调节而获得精确的位置信息进行的。爬行类成年的多疣壁虎的尾巴断掉之后也能够精确地再生出丢失的部分。我们首先从壁虎中枢神经文库中成功获得编码壁虎CD59蛋白的基因全长序列。RT-PCR结果表明壁虎CD59转录本在沿壁虎正常脊髓的前后轴呈浓度梯度分布,然而在正常尾巴中呈均匀表达。Real-Time-PCR和原位杂交结果表明断尾后1天时,靠近损伤处脊髓中CD59表达急剧显著增加,而3天呈现下降趋势直到1周时下降到接近正常水平,然而到2周时又呈现上调趋势。芽基原位杂交结果显示1周时受损处脊髓尖端芽基间充质样细胞有CD59阳性信号出现,到20天的时候,断端处CD59阳性信号较强,且沿着芽基的近远轴(PD轴)呈递减趋势。注射视磺酸(RA)后,芽基中CD59表达量上调。体外进行近侧区芽基组织块与远侧区芽基组织块的共培养,我们发现近侧区芽基能够吞噬远侧区芽基,而这一过程可以被CD59抗体所阻断。由此我们得出壁虎CD59基因参与了断尾再生过程中位置信息的建立。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-9
第一章绪论  9-14
  1.1 课题来源  9
  1.2 课题研究的目的和意义  9-10
  1.3 国内外研究概况  10-13
    1.3.1 国外研究概况  10-11
    1.3.2 国内研究概况  11-13
  1.4 论文的主要研究内容  13-14
第二章材料与方法  14-32
  2.1 材料  14-20
    2.1.1 动物  14
    2.1.2 试剂及实验相关耗材  14-16
    2.1.3 试剂配制  16-19
    2.1.4 实验仪器  19-20
  2.2 方法  20-32
    2.2.1 壁虎组织的取材  20
    2.2.2 总RNA 提取  20
    2.2.3 cDNA 末端快速扩增（RACE）实验  20-22
    2.2.4 PCR产物的回收及克隆  22
    2.2.5 连接产物的转化  22
    2.2.6 重组子筛选（蓝白斑试验）  22
    2.2.7 质粒抽提  22-23
    2.2.8 克隆鉴定和序列测定  23
    2.2.9 逆转录反应  23
    2.2.10 全长基因的获得  23-24
    2.2.11 特异性探针的合成  24-25
    2.2.12 Northern blot  25-26
    2.2.13 细胞转染  26-27
    2.2.14 细胞的染色  27-28
    2.2.15 原位杂交(ISH)  28-29
    2.2.16 Real-Time PCR  29
    2.2.17 Western blot检测壁虎脊髓中CD59 蛋白  29-30
    2.2.18 RT-PCR  30-31
    2.2.19 近远端芽基组织块的共培养  31
    2.2.20 RA注射壁虎断尾模型的建立  31
    2.2.21 HE染色  31-32
第三章结果  32-50
  3.1 壁虎CD59 基因的克隆及其特征  32-37
    3.1.1 总RNA的检测  32
    3.1.2 5’RACE结果  32-33
    3.1.3 5’RACE产物克隆的酶切鉴定、测序  33
    3.1.4 CD59 cDNA全长序列的拼接  33-34
    3.1.5 CD59 的全长克隆  34
    3.1.6 生物信息学分析  34-37
  3.2 Northern Blot分析  37-39
    3.2.1 CD59 的探针合成  37-38
    3.2.2 壁虎各个组织的总RNA电泳  38-39
    3.2.3 Northern blot 结果  39
  3.3 正常壁虎脊髓近远轴上各段CD59 表达及定位情况  39-42
    3.3.1 RT-PCR结果  39-40
    3.3.2 原位杂交检测CD59 mRNA在脊髓各段上定位情况  40-42
  3.4 正常壁虎尾巴近远轴上各段CD59 表达及定位情况  42
    3.4.1 RT-PCR结果  42
    3.4.2 原位杂交检测CD59 mRNA在尾巴各段上定位情况  42
  3.5 CD59 蛋白在壁虎G5113 细胞株中的定位及其过表达对细胞突起的影响  42-43
  3.6 断尾后脊髓中CD59 的表达变化  43-44
    3.6.1 Real Time-PCR观察损伤前后各时间点的CD59 的表达差异  43-44
    3.6.2 CD59 mRNA在正常及断尾损伤脊髓下段中的阳性信号的变化..  44
  3.7 Western-blot验证抗体试验  44-45
  3.8 近远侧芽基组织块共培养  45-46
  3.9 不同时间点芽基组织形态（HE染色）  46-47
  3.10 不同时间点芽基组织近远端CD59 表达定位情况  47-49
  3.11 RA注射模型不同时间点芽基组织近远端CD59 表达定位情况  49-50
第四章讨论  50-53
第五章结论  53-54
参考文献  54-58
英文缩略词  58-60
综述  60-69
  综述参考文献  66-69
作者在攻读硕士学位期间公开发表的论文及参加的项目  69-70
致谢  70

多疣壁虎CD59参与断尾再生过程中近远轴的位置记忆

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