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大麻素受体对神经干细胞分化后神经突起生长的影响及其信号转导机制
作 者: 钟婷婷
导 师: 孙益
学 校: 浙江大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 神经突起 内源大麻素系统 神经干细胞 CB1R CB2R
分类号: Q42
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
本论文研究了大麻素受体激动剂WIN55212-2对小鼠神经干细胞来源的神经元突起生长的影响,并初步探讨了可能的信号转导机制。我们首先利用悬浮神经球的培养方法获得了可连续传代的神经干细胞,免疫荧光化学检测证明获得的神经干细胞呈nestin阳性,并且具有分化为神经元和胶质细胞的潜能,表明了其神经干细胞的特性。为了研究大麻素受体对神经干细胞来源的神经元突起的影响,我们对体外培养的神经干细胞进行了诱导分化使其多数分化为神经元。以往的研究发现哺乳动物存在内源大麻素系统,主要的受体有两种:大麻素一型受体(CB1R)、大麻素二型受体(CB2R)。CB1R主要在神经系统表达,而CB2R最初被认为只在外周系统表达,后来研究发现CB2R亦在在中枢神经系统表达。本论文中我们利用RT-PCR方法检测到原代神经元、胶质细胞、神经干细胞以及神经干细胞诱导分化后细胞均有表达这两种受体。WIN55212-2是CB1R和CB2R非选择性的激动剂,可以同时作用于CB1R和CB2R。突起形态分析实验结果显示WIN55212-2可以促进分化神经干细胞的突起生长,并且呈浓度依赖性。100nM WIN55212-2处理组突起长度为65.25±4.462μm,与对照组(50.03±7.038μm)有着显著性差异,并且该作用可同时被CB1R选择性的拮抗剂SR141716a和CB2R选择性拮抗剂AM630所阻遏,说明WIN55212-2促进神经突起生长需要同时激活CB1R和CB2R。通过Western Blot方法,我们发现WIN55212-2可以引起ERK1/2和STAT3信号途径较长时间的活化,但对ERK的活化不及STAT3明显。同时,结合多种信号通路抑制剂对神经突起的形态分析结果显示,PKA和ERK1/2的抑制剂并不能阻遏WIN55212-2促神经突起生长的作用,而P13K抑制剂Wortmannin完全抑制了WIN55212-2的作用,PKC抑制剂Go6983则部分抑制了该作用。以上结果表明WIN55212-2主要通过激活P13K和PKC途径促进神经突起的生长,而ERK1/2途径的激活并不是WIN55212-2促进神经突起生长所必需。
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全文目录
致谢 4-5 摘要 5-6 ABSTRACT 6-11 第1章 前言 11-20 1.1 神经突起的生长 12 1.2 内源大麻素系统 12 1.3 大麻素受体 12-14 1.4 大麻素受体的激动剂和拮抗剂 14-15 1.5 在CNS的信号转导途径 15-16 1.6 研究内容 16 参考文献 16-20 第2章 小鼠神经干细胞的培养和鉴定 20-32 2.1 试剂与材料 20-24 2.1.1 实验动物 20 2.1.2 器材 20-21 2.1.3 试剂及溶液 21 2.1.4 细胞培养液 21 2.1.5 抗体 21-22 2.1.6 小鼠前脑神经干细胞的原代培养 22 2.1.7 神经干细胞的传代培养 22-23 2.1.8 神经干细胞的分化 23 2.1.9 神经干细胞的免疫学鉴定 23-24 2.2 结果 24 2.2.1 神经球的形成 24 2.2.2 神经干细胞的免疫鉴定 24 2.2.3 神经干细胞的分化及免疫鉴定 24 2.3 讨论 24-29 2.3.1 神经干细胞的培养 24-27 2.3.2 神经干细胞的免疫鉴定 27 2.3.3 神经干细胞的分化 27-29 小结 29-30 参考文献 30-32 第3章 大麻素受体CB1R和CB2R在不同神经细胞上的表达 32-43 3.1 试剂与器材 32-33 3.1.1 器材 32 3.1.2 试剂及溶液 32-33 3.2 材料与方法 33-36 3.2.1 动物 33-34 3.2.2 实验设计 34 3.2.3 总RNA的提取 34 3.2.4 RT-PCR 34-36 3.2.5 DNA电泳 36 3.2.6 数据分析 36 3.3 结果 36-39 3.4 讨论 39-40 小结 40 参考文献 40-43 第4章 WIN55212-2对神经突起生长的影响 43-57 4.1 试剂与器材 43-44 4.1.1 实验动物 43 4.1.2 试剂 43 4.1.3 培养液与溶液 43-44 4.1.4 器材 44 4.2 实验方法 44-46 4.2.1 小鼠神经干细胞的分离培养与传代 44 4.2.2 神经干细胞的定向诱导分化 44-45 4.2.3 分化后神经元比例的免疫荧光鉴定 45 4.2.4 实验设计 45-46 4.2.5 细胞毒性实验 46 4.2.6 突起测量统计分析方法 46 4.2.7 数据统计 46 4.3 结果 46-50 4.3.1 神经干细胞的定向诱导分化 46-47 4.3.2 WIN55212-2可促进神经元突起生长 47-49 4.3.3 WIN55212-2通过CB1R和CB2R促进神经突起的生长 49-50 4.3.4 细胞毒性检测 50 4.4 讨论 50-55 4.4.1 定向诱导神经干细胞的分化 50-54 4.4.2 大麻碱对神经突起生长的调节 54-55 小结 55 参考文献 55-57 第5章 WIN55212-2影响神经突起生长的信号途径 57-77 5.1 试剂与器材 57-59 5.1.1 试剂 57-58 5.1.2 器材 58 5.1.3 溶液 58-59 5.2 材料与方法 59-64 5.2.1 实验动物 59 5.2.2 抗体 59 5.2.3 培养液 59 5.2.4 神经干细胞的培养及诱导分化 59 5.2.5 实验设计 59-61 5.2.6 Western Blot 61-63 5.2.7 突起长度分析 63 5.2.8 数据分析 63-64 5.3 结果 64-69 5.3.1 WIN55212-2对MAPK(p42/p44)信号途径的调节 64-65 5.3.2 WIN55212-2对STAT3信号途径的调节 65-66 5.3.3 不同信号通路抑制剂对神经细胞突起形态的影响 66-69 5.4 讨论 69-73 5.4.1 大麻素受体信号转导途径 69-70 5.4.2 STAT3信号通路与突起生长 70-72 5.4.3 ERK1/2信号途径与突起生长 72 5.4.4 PI3K/PKC信号途径与突起生长 72-73 5.4.5 其他 73 小结 73-74 参考文献 74-77 总结与展望 77-80 参考文献 79-80 综述 80-92 参考文献(Rerferences) 88-92 攻读硕士学位期间发表的相关论文 92
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中图分类: > 生物科学 > 生理学 > 神经生理学
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