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甲醛分解途径关键酶的原核表达与纯化及应用研究

作　者: 张婧
导　师: 陈丽梅
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: GSH-依赖型甲醛解毒途径甲醛脱氢酶硫-甲酰谷胱甘肽水解酶甲酸脱氢酶原核表达甲醛污染
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

甲醛是室内空气污染的主要来源之一,很多建筑装饰材料都含有甲醛,甲醛性质活泼,反应能力极强,能与蛋白质、核酸、脂类产生非特异性的反应,对人体健康具有很大的危害。利用物理吸附法或化学药剂消除法治理甲醛污染存在效果不明显或产生二次污染等弊端。利用植物或酶法来治理甲醛污染,使其最终产生无毒的C02,具有经济、环保、不产生二次污染等优点。谷胱甘肽(GSH)-依赖的甲醛解毒途径是生物体广泛存在的一个甲醛修复系统,GSH-依赖型甲醛脱氢酶(ADH)、S-甲酰谷胱甘肽水解酶(FGH)、甲酸脱氢酶(FDH)是这条解毒途径的三个关键酶。但是来自恶臭假单胞杆菌的甲醛脱氢酶(PADH)则是一个不需GSH而依赖NAD+的甲醛脱氢酶。本研究分别以大肠杆菌、恶臭假单胞杆菌、博伊丁假丝酵母菌基因组为模板扩增大肠杆菌的ADH基因(Eadh)和FGH基因(fgh)、恶臭假单胞杆菌的ADH基因(padh)以及博伊丁假丝酵母的FDH基因(fdh),同时通过酶切从拟南芥GSH-依赖型甲醛脱氢酶基因(Atadh)的TA克隆载体pMD18-T-Atadh(宋中邦硕士论文)中获得Atadh基因片段,经过TA克隆、酶切、连接后,成功构建了这些基因的原核表达载体pET32a(+)-Eadh、pET28a(+)-padh、pET32a(+)-fgh、pET28a(+)-fdh、pET32a(+)-Atadh。将上述表达载体转化大肠杆菌蛋白表达专用宿主菌株BL21或Rosseta,然后进行各目的蛋白的诱导表达,通过调节IPTG诱导浓度、温度、诱导时间最终确定了各目的蛋白的最佳表达条件,所有目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的70%以上。实验发现这几个重组蛋白在宿主菌中都存在不同程度的包涵体表达,其中来自E.coli的EADH、拟南芥的AtADH、E.coli的FGH表现尤为明显,包涵体蛋白占所表达重组蛋白的80%以上。对AtADH、FGH、FDH重组蛋白采取割胶纯化的方法,最终从包涵体中获得较为纯净的目的蛋白,作为抗原用于抗体的制备,抗体免疫结果显示几个蛋白的血清效价基本都达到10-4。PADH、FDH重组蛋白在可溶性蛋白中的含量相对较高一些,通过大规模培养、亲和层析、硫酸铵沉淀最后纯化出纯度较高的可溶性PADH、FDH重组蛋白。酶活测定结果显示PADH、FDH两个重组蛋白均有较高的催化活性和热稳定性。其中PADH在30℃-40℃下均具有较高催化活性,最大酶活为1.95U/mg,最适酶反应温度为50℃,65℃保温10min后仍具有60%的活性。FDH在30℃-50℃的环境下酶活变化不大,40℃时酶活性达到最高,为0.376U/mg,65℃保温100min后仍具有51%的相对活性,与PADH相比,FDH具有更为广泛的温度适用范围和高温耐受性。蛋白变性剂抗性试验证明：在高浓度以及长时间的盐酸胍处理下,两个酶蛋白活性都会受到很大影响。本研究经过表达纯化后获得了具有一定活性的PADH、FDH重组蛋白,且热稳定性较好,将两个重组蛋白及辅因子NAD+固定到载体基质上,并对固定化酶甲醛吸收效果进行初步分析,结果显示固定化酶具有一定的甲醛吸收效果。本研究PADH、FDH重组蛋白固定化酶吸收甲醛的效果分析数据对室内甲醛污染的酶法治理有一定的参考价值,AtADH、FGH、FDH酶蛋白相应抗体的制备成功也为将来甲醛代谢基因工程研究提供了强有力的检测工具。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-11
插图和附表清单  11-14
缩略词  14-16
第一章前言  16-37
  1.1 甲醛污染的现状以及防治措施  16-18
    1.1.1 甲醛的性质以及对人体的危害性  16
    1.1.2. 我国室内甲醛污染的现状  16-17
    1.1.3 甲醛污染的防治措施  17-18
  1.2 生物体的甲醛分解途径  18-20
  1.3 甲醛脱氢酶的简介  20-25
    1.3.1 甲醛脱氢酶的生理作用  20
    1.3.2 甲醛脱氢酶的生化特性和动力学反应机制  20-22
    1.3.3 甲醛脱氢酶的结构特征  22-23
    1.3.4 甲醛脱氢酶的基因研究进展以及表达调控机制  23-25
    1.3.5 甲醛脱氢酶的应用  25
  1.4 硫-甲酰谷胱甘肽水解酶的简介  25-30
    1.4.1 硫-甲酰谷胱甘肽水解酶的生理作用  25-26
    1.4.2 硫-甲酰谷胱甘肽水解酶的生化特性  26-28
    1.4.3 硫-甲酰谷胱甘肽水解酶的结构特征  28-29
    1.4.4 硫-甲酰谷胱甘肽水解酶的基因研究进展  29-30
  1.5 甲酸脱氢酶的简介  30-35
    1.5.1 甲酸脱氢酶的生理作用  30
    1.5.2 甲酸脱氢酶的生化特性  30-32
    1.5.3 甲酸脱氢酶的结构特征  32-33
    1.5.4 甲酸脱氢酶的基因研究进展和催化反应机制  33-34
    1.5.5 甲酸脱氢酶的应用  34-35
  1.6 本研究的主要内容和意义  35-37
    1.6.1 本研究的主要内容  35-36
    1.6.2 本研究的意义  36-37
第二章材料与方法  37-53
  2.1 材料  37-40
    2.1.1 菌株和质粒  37
    2.1.2 主要试剂  37
    2.1.3 主要仪器  37-38
    2.1.4 主要培养基  38-40
  2.2 实验方法  40-53
    2.2.1 引物合成  40-41
    2.2.2 引物稀释  41
    2.2.3 基因组的提取方法  41-42
    2.2.4 质粒的提取方法  42-43
    2.2.5 PCR方法  43-44
    2.2.6 DNA电泳检测以及胶回收  44-45
    2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  45-46
    2.2.8 PCR产物的TA克隆  46-47
    2.2.9 目的基因片段与原核载体的连接  47
    2.2.10 目的蛋白重组菌的构建表达与蛋白纯化方法  47-51
    2.2.11 目的蛋白的酶活检测及稳定性分析方法  51-52
    2.2.12 酶蛋白的固定及甲醛吸收效果的测定  52-53
第三章实验结果  53-91
  3.1 GSH-依赖型甲醛脱氢酶蛋白(ADH)的制备  53-63
    3.1.1 pET32a(+)-Eadh原核表达载体的构建  53-57
    3.1.2 EADH重组蛋白的表达  57-59
    3.1.3 pET32a(+)-Atadh原核表达载体的构建  59-61
    3.1.4 AtADH重组蛋白的表达  61-62
    3.1.5 AtADH重组蛋白抗体制备的效价结果  62-63
  3.2 GSH-非依赖型甲醛脱氢酶蛋白(PADH)的制备  63-73
    3.2.1 pET28a(+)-padh原核表达载体的构建  63-68
    3.2.2 PADH重组蛋白的表达  68-70
    3.2.3 PADH重组蛋白的酶活检测及应用性分析  70-73
  3.3 S-甲酰谷胱甘肽水解酶蛋白(FGH)的制备  73-79
    3.3.1 pET32a(+)-fgh原核表达载体的构建  73-77
    3.3.2 FGH重组蛋白的表达  77-78
    3.3.3 FGH重组蛋白抗体制备的效价结果  78-79
  3.4 甲酸脱氢酶蛋白(FDH)的制备  79-90
    3.4.1 pET28a(+)-fdh原核表达载体的构建  79-83
    3.4.2 FDH重组蛋白的表达  83-87
    3.4.3 FDH重组蛋白抗体制备的效价结果  87
    3.4.4 FDH重组蛋白的酶活检测及应用性分析  87-90
  3.5 酶蛋白的固定  90-91
第四章讨论  91-98
  4.1 大肠杆菌表达系统的选择  91
  4.2 宿主菌以及表达载体的选择  91-92
  4.3 目的蛋白在宿主菌的表达情况分析  92-93
  4.4 目的蛋白的分离纯化  93-94
  4.5 目的蛋白的酶活及其稳定性的分析讨论  94-97
    4.5.1 GSH-非依赖型甲醛脱氢酶重组蛋白  94-95
    4.5.2 甲酸脱氢酶重组蛋白  95-97
  4.6 固定化酶对甲醛吸收效果的初步探索  97-98
第五章总结和展望  98-100
  5.1 总结  98
  5.2 展望  98-100
致谢  100-101
参考文献  101-110
附录A 攻读硕士期间发表论文及申请专利目录  110

甲醛分解途径关键酶的原核表达与纯化及应用研究

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