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前纳豆激酶原基因的克隆与表达

作　者: 郭文秀
导　师: 哈斯阿古拉
学　校: 内蒙古大学
专　业: 微生物学
关键词: 前纳豆激酶原基因枯草芽孢杆菌纳豆激酶大肠杆菌表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由枯草芽孢杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，该酶具有强烈溶栓活性。本研究的目的是克隆前纳豆激酶原基因，实现其在大肠杆菌中的表达，并对其表达条件进行研究。方法是从枯草芽胞杆菌中分离纯化基因组DNA作为模板，通过PCR扩增前纳豆激酶原基因，将其克隆到质粒pUC19中，构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α，序列分析结果表明，所克隆片段全长1152bp，与Genebank中已报道序列相比较，同源性达到100％。将目的基因片段分别与表达载体pBV220和pET30a连接，构建重组表达质粒pBNK和pENK，分别转化大肠杆菌HB101和BL21(DE3)，用温度诱导转化菌pBNK6-HB101，表达产物经SDS-PAGE电泳观察到了特异条带，不同诱导温度、时间及培养基比较实验结果显示，转化菌pBNK6-HB101在BL培养基中30℃培养，42℃诱导7小时表达量达到最大，约占菌体总蛋白的25％。用IPTG诱导转化菌pENK108-BL21(DE3)，表达产物经SDS-PAGE电泳观察到了特异条带，Western blot检测到了目的蛋白。转化菌pENK108-BL21(DE3)在BL培养基中37℃培养，1mM IPTG诱导4小时表达量达到最大，约占菌体总蛋白的31％。

全文目录

引言  8-10
一、材料与方法  10-15
  1、材料  10
    1.1 菌种与质粒  10
    1.2 试剂  10
  2、方法  10-15
    2.1 前纳豆激酶原基因PCR扩增  10-11
    2.2 前纳豆激酶原基因克隆  11-12
    2.3 表达载体构建  12
    2.4 转化菌诱导表达研究  12-15
二、结果与分析  15-26
  1、基因克隆  15-18
    1.1 前纳豆激酶原基因的PCR扩增  15
    1.2 克隆载体的构建和筛选  15-16
    1.3 重组质粒检测  16-18
  2、重组及转化  18-21
    2.1 表达载体构建  18-19
    2.2 重组表达质粒PCR检测  19-20
    2.3 重组表达质粒酶切检测  20-21
  3、转化菌诱导表达研究  21-26
    3.1 转化菌pBNK6-HB101诱导表达SDS-PAGE凝胶电泳检测  21
    3.2 对宿主菌生长规律的影响  21-22
    3.3 诱导时间对转化菌pBNK6-HB101表达的影响  22
    3.4 诱导温度对转化菌pBNK6-HB101表达的影响  22-23
    3.5 培养基对转化菌pBNK6-HB101表达的影响  23-24
    3.6 转化菌pENK108-BL21(DE3)表达产物Western Blotting检测  24-26
三、讨论  26-28
四、参考文献  28-30
五、文献综述  30-46
  参考文献  42-46
致谢  46

前纳豆激酶原基因的克隆与表达

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